Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Numerosos patógenos bacterianos han adaptado estrategias generalizadas para explotar células huésped para la supervivencia y replicación en un compartimiento intracelular. En muchos casos, los mecanismos patogénicos son similares entre protozoos y metazoos células. Sin embargo, estos dos microambientes son muy diferentes y pueden resultar en la expresión diferencial de los factores de virulencia ^1-4. La enfermedad del legionario bacteria Legionella pneumophila doquier se asocian con ambientes de agua dulce en todo el mundo ^5. Es importante destacar que, L. pneumophila cultivada en células de protozoos antes de la infección de los monocitos humanos obtener una ventaja patógena, lo que sugiere que los perfiles de expresión génica global de la bacteria sale de una célula de protozoo son diferentes que la de la vitro en cultivo organismo ^6-8. En la naturaleza, las amebas de agua dulce proporcionan nutrientes ricos confines de la rápida amplificación de una bacteria invasora. Adquisición humano de L. pneumophila es más a menudo atribuida a la inhalación de gotitas de agua contaminadas que contienen la bacteria. Es probable que estas gotitas puerto protozoarios asociados a las células bacterias; donde las células de protozoos son más resistentes a las prácticas convencionales de tratamiento de agua ^9,10. La infección de macrófagos alveolares pulmonares procede de una manera casi idéntica a la del ciclo de vida intracelular de la bacteria en las células huésped de protozoos ^11-13.

Con el fin de sobrevivir y replicarse en células eucariotas, L. pneumophila utiliza un tipo especializado sistema de secreción IVb denominado Dot / Icm llegar a casi el 300 'ejecutor' proteínas en el citosol de la célula huésped ^14-16. Estas proteínas efectoras colectivamente funcionar para subvertir procesos celulares con el fin de generar un compartimiento de replicación permisiva para la bacteria ^17,18. Las deleciones en cualquiera de los 26 genes que constituyen el resultado transportador Dot / Icm en cepas defectuosas para mult intracelulariplication ^19-23. Históricamente, la deleción de genes individuales que codifican efectoras rara vez resultó en cepas atenuadas para el crecimiento intracelular. Este fenómeno se ha atribuido a varias hipótesis, incluida la función redundante y paralogous copias de efectores.

Algunos factores de virulencia se expresan únicamente en el contexto de la célula huésped asociada a crecimiento intracelular ^24. Hemos racionalizado que si un efector particular, se expresa sólo en el contexto de la infección por protozoos, entonces la contribución del efector no podía ser comparada con una cepa de tipo salvaje cuando ambos se cultivaron in vitro. L. pneumophila transiciones desde un replicativa a una fase de transmisión a medida que entra en la fase estacionaria de cultivo de ^25. El fenotipo de conmutación de fase representa el agotamiento de los nutrientes encontrados durante el crecimiento intracelular y se ejemplifica a través del conjunto de los flagelos para la movilidad ^26. Debido a que L. pneumophila es más invasive y virulenta cuando se cosecha a partir de células de protozoos, hemos tratado de desarrollar un ensayo que más fielmente representa el estado patógeno de la bacteria cuando se encontró con los macrófagos de acogida.

Para este fin, hemos desarrollado un ensayo protozoo cebado versátil que puede adaptarse a cualquier huésped adecuado tanto para las infecciones de la primera etapa (cebado de células) y segundo (célula diana). El proceso de infección es tratable mediante el uso de bacterias que expresan establemente la proteína verde fluorescente (GFP). El modelo de la infección por el protozoo Acanthamoeba castellanii sigue una metodología ampliamente utilizado en el campo ^27. Para la etapa de cebado, L. pneumophila cepas se cultivan in vitro hasta la fase estacionaria en medio líquido para producir la etiqueta 'transmisivo "bacterias (Figura 1A). Las bacterias se vuelva a utilizar para infectar monocapas de A. castellanii durante 18 horas para lograr una etapa tardía del ciclo de vida intracelular. Contienen grandes vacuolasbacterias ING puede ser visualizado en este punto de tiempo usando microscopía de fluorescencia (Figura 1A). Las células se lisan por protozoos y bacterias recuperadas a partir del lisado se miden para emisión a 512 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia. La fluorescencia se correlaciona con la densidad óptica para calcular multiplicidad de infección (MOI) en la infección de células diana (Figura 1, Curva * Correlación). Después de la invasión h (T ₀₎ y 18 post-invasión (T _18), las células diana se cuantifican por fluorescencia, en representación de las bacterias intracelulares. La fluorescencia puede ser monitoreada por microscopía y citometría de flujo, y el recuento de viables se puede medir a través de placas de colonias. El ensayo de cebado siempre se acompaña de infecciones por L. de tipo salvaje pneumophila y una cepa defectuosa en el sistema Dot / Icm de secreción de tipo IV (Δ dotA) (Figura 1A). Este importante proporciona controles internos para las comparaciones directas entre los de tipo salvaje unnd cualquier cepas isogénicas mutantes utilizados en el proceso de infección. La inclusión de la cepa no virulenta Δ dotA durante la fase de cebado establece un umbral para la observación de fenotipos de crecimiento atenuadas asociados con cepas mutantes isogénicas que se cultivan in vitro.