Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

De nombreux agents pathogènes bactériens ont adopté des stratégies généralisées pour exploiter les cellules hôtes pour la survie et la reproduction dans un compartiment intracellulaire. Dans de nombreux cas, les mécanismes pathogéniques sont similaires entre les protozoaires et les métazoaires cellules. Cependant, ces deux micro sont très différents et peuvent aboutir à l'expression différentielle des facteurs de virulence ^1-4. La légionellose bactérie Legionella pneumophila est ubiquitaire associés à des environnements d'eau douce dans le monde ^5. Surtout, L. pneumophila cultivé dans des cellules de protozoaires avant l'infection des monocytes humains obtenir un avantage pathogène, ce qui indique que les profils d'expression des gènes globales de la bactérie sortant d'une cellule de protozoaire est différente de celle de l'organisme cultivé in vitro en ^6-8. Dans la nature, les amibes d'eau douce constituent des nutriments riches limites pour l'amplification rapide d'une bactérie envahissante. Acquisition humaines de L. pneumophila est le plus souvent attribuée à l'inhalation de gouttelettes d'eau contaminées qui contiennent la bactérie. Il est probable que ces gouttelettes port protozoaires associées aux cellules des bactéries; où les cellules de protozoaires sont plus résistants aux pratiques conventionnelles de traitement de l'eau ^9,10. L'infection de macrophages alvéolaires pulmonaires produit d'une manière presque identique au cycle de vie intracellulaire de la bactérie dans les cellules hôtes protozoaires ^11-13.

Afin de survivre et se reproduire dans les cellules eucaryotes, L. pneumophila utilise un système de sécrétion de type spécialisé IVb appelé Dot / Icm de livrer près de 300 «effecteurs des protéines dans le cytosol de la cellule hôte ^14-16. Ces protéines effectrices collectivement fonctionner pour renverser les processus cellulaires afin de générer un compartiment de réplication permissive pour la bactérie ^17,18. Suppressions dans l'un des 26 gènes qui composent le résultat transporteur Dot / Icm dans des souches défectueuses pour mult intracellulaireiplication ^19-23. Historiquement, la suppression des différents gènes codant pour effectrices rarement abouti à des souches atténuées pour la croissance intracellulaire. Ce phénomène a été attribué à plusieurs hypothèses incluant la fonction de redondance et des copies paralogues des effecteurs.

Certains facteurs de virulence ne sont exprimés dans le contexte de la croissance intracellulaire de la cellule hôte associée ^24. Nous avons rationalisé que si un effecteur particulier a été exprimé que dans le contexte de l'infection protozoaire, la contribution de l'effecteur ne pouvait pas être comparée à une souche de type sauvage quand les deux ont été cultivées in vitro. L. pneumophila transitions d'une réplication à une phase de transmission en ce début de phase stationnaire dans la culture ^25. Le phénotype commutation de phase représente l'épuisement des nutriments rencontrée lors de la croissance intracellulaire et est illustrée à travers l'ensemble de flagelles pour la mobilité ^26. Parce que L. pneumophila est plus invasive et virulent lorsqu'il est récolté à partir des cellules de protozoaires, nous avons cherché à développer un test qui plus fidèlement représenté l'état pathogène de la bactérie quand il a rencontré macrophages de l'hôte.

À cette fin, nous avons développé un test d'amorçage protozoaire polyvalent qui peut accueillir n'importe quel hôte convenable pour les deux premiers (cellule d'amorçage) et deuxième infections scène (cellule cible). Le processus d'infection est traitable par l'utilisation de bactéries exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP). Le modèle d'infection pour le protozoaire castellanii Acanthamoeba suit une méthodologie largement utilisée dans le domaine ^27. Pour l'étape d'amorçage, L. pneumophila souches sont cultivées in vitro jusqu'à la phase stationnaire dans des milieux liquides pour produire portant la mention «transmetteurs» bactéries (figure 1A). Les bactéries sont ensuite utilisés pour infecter des monocouches de A. castellanii pendant 18 heures pour atteindre un stade tardif du cycle de vie intracellulaire. Grandes vacuoles contiennenttion des bactéries peuvent être visualisés à ce point dans le temps en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1A). Cellules sont ensuite lysées protozoaires et bactéries récupérées à partir du lysat sont mesurées pour l'émission à 512 nm en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence. La fluorescence est corrélée avec la densité optique de calculer la multiplicité de l'infection (MOI) pour l'infection de cellules cibles (figure 1, la courbe de corrélation *). H après l'invasion (T ₀₎ et 18 post-invasion (T _18), les cellules cibles sont quantifiés pour la fluorescence, ce qui représente des bactéries intracellulaires. La fluorescence peut être suivie en microscopie et cytométrie de flux, et les numérations viables peut être mesurée par placage colonie. Le test d'amorçage est toujours accompagnée par des infections de type sauvage avec L. pneumophila et une souche défectueux dans le système Dot / Icm de sécrétion de type IV (Δ DOTA) (figure 1A). Cela permet surtout de contrôle interne pour les comparaisons directes entre un type sauvagend des souches isogéniques mutantes utilisées dans le processus d'infection. L'inclusion de la souche virulente Δ Dota pendant la phase d'amorçage fixe un seuil pour l'observation des phénotypes de croissance atténués associés à isogéniques souches mutantes qui sont cultivées in vitro.