لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا
Summary
هذه التقنية يوفر طريقة لجني، وتطبيع وقياس النمو داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية التي تم مسبقا المزروعة في الطبيعية الخلايا المضيفة الأوالي قبل التهابات خلايا الثدييات. يمكن تعديل هذه الطريقة لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة للمرحلة فتيلة وكذلك أنواع الخلايا المستهدفة.
Abstract
العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استخدام الخلايا الأوليات المياه العذبة الطبيعية كمستودع للانتشار في البيئة. الفيلقية المستروحة، العامل المسبب للالتهاب الرئوي يدجينيرز "، يسعى إلى اكتساب ميزة على الممرضة في المختبر البكتيريا مثقف عندما تحصد الأولى من الخلايا وحيدة الخلية قبل إصابة الضامة الثدييات. هذا يشير إلى أن هناك عوامل قد لا يمكن التعبير عنها الفوعة المهم بشكل صحيح في المختبر. قمنا بتطوير نظام للين العريكة L. فتيلة المستروحة من خلال المضيف الطبيعي الأوالي الشوكميبة castellanii قبل للإصابة خلايا الثدييات. يمكن فحص مساهمة أي عامل الفوعة بمقارنة النمو داخل الخلايا متحولة إلى سلالة البرية من نوع البكتيريا بعد فتيلة الأوالي. ، معربا عن GFP L. البرية من نوع ومتحولة وتستخدم سلالات المستروحة لتصيب monolayers الأوالي في خطوة فتيلة وسمح للوصول إلى المراحل المتأخرة من نمو الخلايا. ثم يتم حصاد هذه البكتيريا الفلورسنت من الخلايا المصابة وتطبيع بواسطة القياس الطيفي لتوليد أرقام قابلة للمقارنة من البكتيريا لعدوى لاحقة في الضامة الثدييات. لالكمي، ويتم رصد البكتيريا الحية بعد الإصابة باستخدام المجهر مضان، التدفق الخلوي، والطلاء مستعمرة. هذه التقنية تعتمد على الضوء ومساهمة الجينات التعبير المضيف الخلية التي تعتمد على عن طريق محاكاة البيئة التي ستواجه في طريق اكتساب الطبيعية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب أي بكتيريا يستخدم المضيف الوسيط كوسيلة لكسب ميزة المسببة للأمراض.
Introduction
وقد تكيفت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استراتيجيات عامة لاستغلال الخلايا المضيفة من أجل البقاء والتكرار في حجرة داخل الخلايا. في كثير من الحالات، وآليات متشابهة بين الممرضة والخلايا metazoan الأوالي. ومع ذلك، فإن هذه microenvironments مختلفان جدا ويمكن أن يؤدي إلى التعبير الفرق من عوامل الفوعة 1-4. ويرتبط بتواجد مطلق هذه الكتائب 'المرض بكتيريا البكتيريا المستروحة مع بيئات المياه العذبة في جميع أنحاء العالم 5. الأهم من ذلك، L. المستروحة المزروعة في خلايا الأوالي قبل إصابة الإنسان حيدات اكتساب ميزة المسببة للأمراض، مما يوحي بأن ملامح التعبير الجيني العالمي للبكتيريا تخرج خلية الأوالي مختلفة من أن من يزرع في المختبر الكائن 6-8. في الطبيعة، الأميبات المياه العذبة توفير حدود الغنية بالمغذيات لتضخيم السريع للبكتيريا الغازية. الإنسان اقتناء L. pneumophوغالبا ما تعزى إلى دائرة الأراضي استنشاق قطرات المياه الملوثة التي تحتوي على البكتيريا. ومن المرجح أن هذه قطرات الميناء الأوالي الخلية المرتبطة البكتيريا؛ حيث الخلايا وحيدة الخلية هي أكثر مقاومة للممارسات التقليدية لمعالجة المياه 9،10. إصابة عائدات الرئة الضامة السنخية بطريقة مماثلة تقريبا لدورة حياة الخلايا من البكتيريا في الخلايا المضيفة الأوالي 11-13.
من أجل البقاء على قيد الحياة والتكاثر في الخلايا حقيقية النواة، L. المستروحة يستخدم نظام IVB المتخصصة إفراز نوع يسمى دوت / ICM لتقديم ما يقرب من 300 "المستجيب" البروتينات في العصارة الخلوية للخلية المضيفة 14-16. هذه البروتينات تعمل بشكل جماعي المستجيب لتخريب العمليات الخلوية من أجل توليد حجرة النسخ المتماثل للبكتيريا الإباحية 17،18. الحذف في أي من الجينات ال 26 التي تتألف منها نتيجة نقل دوت / ICM في سلالات الخلايا التالفة لmultiplication 19-23. تاريخيا، حذف الجينات الفردية ترميز المستجيب نادرا ما أسفرت سلالات موهنة للنمو داخل الخلايا. وقد تعزى هذه الظاهرة إلى عدة فرضيات بما في ذلك وظيفة زائدة عن الحاجة ونسخ paralogous من المستجيبات.
وأعرب فقط بعض عوامل الفوعة في سياق النمو داخل الخلايا المضيفة الخلية المرتبطة 24. ترشيد أننا إذا وأعرب سوى المستجيب سيما في سياق الإصابة الأوالي، ثم لا يمكن أن مساهمة المستجيب يمكن مقارنتها مع سلالة من النوع البري عندما تم تربيتها على حد سواء في المختبر. L. المستروحة التحولات من تنسخي قابل للنقل إلى مرحلة وهي تدخل مرحلة ثابتة في الثقافة 25. النمط الظاهري التحول يمثل مرحلة نضوب المغذيات واجهتها خلال النمو داخل الخلايا ويتمثل من خلال جمعية حركية للسياط 26. لأن L. المستروحة أكثر invaسعينا SIVE وضراوة عندما تحصد من الخلايا وحيدة الخلية، وضع مقايسة أن أكثر بأمانة تمثل الدولة المسببة للأمراض من البكتيريا عندما واجهت الضامة المضيف.
ولهذه الغاية، قمنا بتطوير فتيلة الأوالي تنوعا الفحص التي يمكن أن تستوعب أي مضيف مناسبة لكلا من الإصابات الأولى (الخلية فتيلة) والمرحلة الثانية (الخلية الهدف). عملية العدوى لين العريكة من خلال استخدام البكتيريا التعبير عن ثابت بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نموذج للعدوى castellanii الشوكميبة الأوالي يتبع المنهجية المستخدمة على نطاق واسع في مجال 27. للخطوة فتيلة، L. تزرع سلالات المستروحة في المختبر لمرحلة ثابتة في وسائل الإعلام لإنتاج السائل "قابل للنقل" المسمى البكتيريا (الشكل 1A). وتستخدم القادمة البكتيريا لتصيب monolayers من A. castellanii لمدة 18 ساعة لتحقيق مرحلة متأخرة من دورة الحياة داخل الخلايا. فجوات كبيرة تحتوي علىويمكن تصور جي البكتيريا في هذه المرحلة باستخدام المجهر مضان الوقت (الشكل 1A). وهي lysed ثم الخلايا الأوالي ويتم قياس البكتيريا التي عثر عليها على المحللة للالانبعاثات في 512 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مضان. ويرتبط مضان مع الكثافة البصرية لحساب تعدد من بين العدوى (وزارة الداخلية) لإصابة الخلايا المستهدفة (الشكل 1، * كيرف الارتباط). بعد ساعة الغزو (T 0) و 18 في مرحلة ما بعد الغزو (T 18)، وكمية الخلايا المستهدفة لمضان، تمثل البكتيريا داخل الخلايا. يمكن رصدها مضان المجهري والتدفق الخلوي، ويمكن قياس التهم قابلة للحياة من خلال الطلاء مستعمرة. ويرافق دائما الفحص عن طريق العدوى مع فتيلة من النوع البري L. المستروحة وسلالة عيب في النظام نوع دوت / ICM إفراز الرابع (Δ DOTA) (الشكل 1A). هذا يوفر الأهم الضوابط الداخلية للمقارنات مباشرة بين البرية من نوع أالثانية أي سلالات متحولة إسوية الجينات المستخدمة في عملية العدوى. إدراج سلالة عديم الفوعة DOTA Δ خلال المرحلة فتيلة يحدد الحد الأدنى لمراقبة الظواهر يضعف من نمو المرتبطة سلالات متحولة إسوية الجينات التي يتم تربيتها في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم التحكم بإحكام البكتيرية التعبير الجيني من خلال مزيج من تقدم دورة الحياة والاستجابة لإشارات في المكروية المحيطة بها. فجوي مسببات الأمراض مثل L. المستروحة الاستجابة لعدد وافر من العظة الخلية المستمدة من المضيف عند مجزأة في يبلوع. ونتيجة لذلك الجماعي استنفاد ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كريج روي والدكتور Zamboni داريو لتقديم نموذج للالتهابات الخلايا وحيدة الخلية. نشكر الدكتور Jagdeep Obhrai الدكتور بوردي جورجيانا، الدكتور فريد Heffron وتود ويزنر للمعدات والكواشف، والدكتور Cambronne ولو لمراجعة نقدية للمخطوطة. تم إجراء التدفق الخلوي في قياس التدفق الخلوي OHSU مرفق الموارد المشتركة. وأيد هذا العمل في جزء من منحة من مؤسسة أبحاث الطبية ولاية أوريغون ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
