זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-
Summary
טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.
Abstract
חיידקים פתוגנים תאי רבה משתמשים הפרוטוזואנים מים מתוקים כמאגר טבעי לשגשוג בסביבה. הלגיונלה pneumophila, הגורם לכך מדלקת הריאות הליגיונרים, זוכה ליתרון על פני בחיידקים פתוגניים בתרבית מבחנה כאשר נקטפו ראשון מתאי protozoan לפני הזיהום של מקרופאגים יונקים. הדבר מרמז כי גורמים ארסיים חשובים לא יכולים לבוא לידי הביטוי כראוי במבחנה. פתחנו מערכת צייתנית ליחולו L. pneumophila דרך מארח protozoan הטבעי Acanthamoeba castellanii לפני הזיהום של תאי יונקים. תרומתו של כל גורם ארסיות ניתן לבדוק על ידי השוואת צמיחה תאית של זן מוטציה לחיידקי סוג פראי לאחר שהכין מראש protozoan. GFP-להביע פראי סוג והמוטציה L. זני pneumophila משמשים להדביק monolayers protozoan בשלב אתחול ואפשרו להגיע לשלבים מאוחרים של גידול תאי. חיידקי פלורסנט אז נקצרים מן התאים הנגועים האלה ונירמול של ספקטרופוטומטריה לייצר מספרים דומים של חיידקים לזיהום לאחר למקרופאגים יונקים. לכימות, חיידקי חיים מנוטרים לאחר הדבקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, cytometry זרימה, ועל ידי ציפוי מושבה. טכניקה זו מדגישה ומסתמכת על התרומה של ביטוי גני התא תלוי מארח על ידי חיקוי הסביבה שהיה נתקלה במסלול רכישה טבעית. גישה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים לכל חיידק שמשתמש מארח מתווך כאמצעי להשגת יתרון פתוגניים.
Introduction
חיידקים פתוגנים רבה יש להתאים את האסטרטגיות כלליות לניצול תאי מארח להישרדות ושכפולה בתא תאי. במקרים רבים, מנגנונים פתוגניים דומים בין תאים מטזואניים protozoan ו. עם זאת, שני microenvironments האלה שונים מאוד ויכול לגרום לביטוי הפרש של 1-4 גורמים ארסיים. המחלה הליגיונרים חיידק הלגיונלה pneumophila קשור ubiquitously עם סביבות מים מתוקים 5 ברחבי העולם. חשוב לציין, L. pneumophila טפח בתאי protozoan לפני הזיהום של מונוציטים אדם להשיג יתרון פתוגניים, מה שמרמז כי פרופילי ביטוי גנים הגלובליים של חיידק יציאת תא protozoan הם שונים מזה של במבחנה טפחה האורגניזם 6-8. בטבע, אמבות מים מתוקים לספק גבולות עשירים ברכיבים מזינים להגברה מהירה של חיידק פולש. רכישה אנושית ל ' pneumophמנהל מקרקעי ישראל הוא לרוב מיוחס לשאיפה של טיפי מים מזוהמים המכילות את החיידק. סביר להניח כי חיידקים אלו טיפי נמל protozoan תאים נלווים; בו תאי protozoan הם עמידים יותר לשיטות טיפול במים קונבנציונליים 9,10. זיהום של תמורת מקרופגים מכתשיים ריאה באופן כמעט זהה למחזור החיים התאי של החיידק בתאי פונדקאי protozoan 11-13.
כדי לשרוד ולהתרבות בתאים האיקריוטים, L. pneumophila משתמש במערכת מיוחדת סוג IVB הפרשה נקראת דוט / ICM כדי לספק כמעט 300 חלבונים 'מפעיל' לcytosol של התא המארח 14-16. חלבונים אלה מפעיל קולקטיבי לתפקד לחתור תחת תהליכים תאיים על מנת ליצור תא מתירנית שכפול לחיידק 17,18. מחיקות בכל של 26 גנים המרכיבים את תוצאת טרנספורטר דוט / ICM בזנים פגומים לmult התאיiplication 19-23. מבחינה הסטורית, מחיקה של גני קידוד מפעיל בודדים כמעט והביאה לזנים מוחלשים לצמיחה תאית. תופעה זו יוחסה לכמה היפותזות כוללים פונקציה מיותרת ועותקים של paralogous effectors.
החלק מהגורמים ארסיים באים לידי ביטוי רק בהקשר של צמיחת מארח תא הקשורים תאית 24. אנו רציונליזציה שאם מפעיל מסוים בא לידי ביטוי רק בהקשר של זיהום protozoan, אז התרומה של המפעיל, אינו יכולה להשתוות עם זן פראי סוג כאשר הן היו בתרבית במבחנה. L. pneumophila מעברים מreplicative לשלב מעביר כפי שהוא נכנס שלב נייח בתרבות 25. פנוטיפ מיתוג השלב מייצג את הדלדול התזונתי נתקל במהלך צמיחה תאית ומודגם באמצעות הרכבה של וטונים לתנועתיות 26. בגלל L. pneumophila הוא inva יותרsive וארסי כשנקצר מתאי protozoan, אנחנו בקשנו לפתח assay שייצג את המדינה הפתוגני של החיידק נאמן יותר כאשר הוא נתקל מקרופאגים המארחים.
לצורך כך, פתח assay יחול protozoan תכליתי שיכול להכיל את כל מארח מתאים לשני (תא המטרה) זיהומי השלב הראשונים (תא יחול) ושניים. תהליך ההדבקה הוא צייתן באמצעות שימוש בחיידקים ביציבות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). המודל לזיהום protozoan Acanthamoeba castellanii כדלקמן המתודולוגיה בשימוש נרחב בתחום 27. לצעד הנפץ, L. זני pneumophila מעובדות במבחנה לשלב נייח בתקשורת הנוזלית לייצור חיידקים שכותרתו "העברה ל'(איור 1 א). חיידקים משמשים הבא כדי להדביק monolayers של A. castellanii עבור 18 שעות כדי להשיג שלב מאוחר של מחזור החיים התאי. וקואולות גדולה מכילהחיידקי ing ניתן דמיינו בנקודת זמן זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א). תאי protozoan מכן lysed וחיידקים התאוששו מlysate נמדדים לפליטה ב512 ננומטר באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. פלואורסצנטי מתואם עם צפיפות אופטית לחישוב ריבוי-of-זיהום (משרד פנים) להדבקת תאי היעד (1 איור, * המתאם Curve). לאחר פלישה (ט 0) ו 18 שלאחר פלישה (ט 18) שעות, תאי יעד לכימות לקרינה, המייצגים חיידקים תוך תאיים. פלואורסצנטי ניתן לפקח על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה, וספירת קיימא ניתן למדוד באמצעות ציפוי מושבה. Assay יחול תמיד מלווה בזיהומים עם ל 'פרא מסוג pneumophila ומתח פגום במערכת דוט / ICM הסוג הרביעית ההפרשה (Δ DotA) (איור 1 א). זה חשוב מספק בקרות פנימיות להשוואה ישירה בין פרא מסוגnd כל זנים מוטנטים isogenic המשמשים בתהליך ההדבקה. ההכללה של זן dota Δ לא האלים בשלב יחול קובעת סף לתצפית של פנוטיפים צמיחה נחלשו קשורים בזנים מוטנטים isogenic כי הם בתרבית במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביטוי גני חיידקי נתונה לפיקוח הדוק באמצעות שילוב של התקדמות ותגובה לאותות בmicroenvironment סביב מחזור חיים. פתוגנים Vacuolar כגון L. pneumophila להגיב לשפע של רמזים מארחים תא המופקים כאשר ממודר בphagosome. כתוצאה קולקטיבית של תשישות תזונתית בתא הפונדקאי, החיידק מפצה על ידי הבעת גורמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר קרייג ורוי ד"ר דריו מחליקים על מתן תבנית לזיהומים סלולריים protozoan. אנו מודים לד"ר Jagdeep Obhrai, ד"ר ג'ורג'יאנה פורדי, ד"ר פרד הפרון וטוד יזנר לציוד וריאגנטים; ד"ר הלול Cambronne לסקירה ביקורתית של כתב היד. cytometry הזרימה בוצע במתקן OHSU תזרים Cytometry המשותף המשאבים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מהקרן למחקר הרפואית של אורגון ומענק NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
