Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un'espressione differenziale di fattori di virulenza ^1-4. Il batterio della malattia del legionario 'Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d'acqua dolce in tutto il mondo ^5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima infezione dei monociti umani acquisire un vantaggio patogeno, suggerendo che globali profili di espressione genica del batterio uscita una cella protozoo sono diverse da quella del coltivati ​​in vitro dell'organismo ^6-8. In natura, amebe acqua dolce forniscono nutrienti confini ricchi per l'amplificazione rapida di un batterio invasore. Acquisizione umana della L. pneumophila è spesso attribuita a inalazione di goccioline di acqua contaminata che contengono il batterio. È probabile che queste goccioline porto protozoi cellula batteri associati; dove cellule protozoarie sono più resistenti alle pratiche convenzionali di trattamento delle acque ^9,10. Infezione di macrofagi alveolari polmonari procede in modo quasi identico al ciclo di vita del batterio intracellulare in cellule ospiti protozoi ^11-13.

Per sopravvivere e replicarsi in cellule eucariotiche, L. pneumophila utilizza uno speciale sistema di secrezione di tipo IV ter chiamato Dot / Icm per fornire circa 300 "effettrici" proteine ​​nel citosol della cellula ospite ^14-16. Queste proteine ​​effettrici collettivamente funzionamento per sovvertire processi cellulari per generare un vano permissive per la replicazione del batterio ^17,18. Delezioni in qualsiasi dei 26 geni che costituiscono il Dot / Icm risultato trasportatore in ceppi difettosi per mult intracellulareiplication ^19-23. Storicamente, cancellazione di singoli geni codificanti effettori raramente portato in ceppi attenuati di crescita intracellulare. Questo fenomeno è stato attribuito a diverse ipotesi tra cui la funzione ridondante e copie paralogous di effettori.

Alcuni fattori di virulenza sono espressi solo nel contesto della cellula ospite associata crescita intracellulare ^24. Abbiamo razionalizzato che se un effettore particolare è stato espresso soltanto nel contesto di infezione protozoo, quindi il contributo del effector non può essere confrontato con un ceppo selvatico quando entrambi sono stati coltivati ​​in vitro. L. pneumophila transizioni da un replicativa a una fase trasmissivo, che entra nella fase stazionaria cultura ^25. Il fenotipo di commutazione fase rappresenta l'esaurimento degli elementi nutritivi incontrato durante la crescita intracellulare ed è esemplificata attraverso il montaggio di flagelli per la motilità ^26. Perché L. pneumophila è più invaSIVE e virulenta quando raccolto da cellule protozoi, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che più fedelmente rappresentato lo stato patogeno del batterio quando ha incontrato macrofagi host.

A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio di adescamento protozoo versatile in grado di ospitare qualsiasi host adatto sia per i primi (cella priming) e la seconda (cella di destinazione) infezioni stadio. Il processo di infezione è trattabile mediante uso di batteri che esprimono stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP). Il modello di infezione per il protozoo Acanthamoeba castellanii segue una metodologia ampiamente usato nel campo ^27. Per la fase di caricamento, L. ceppi pneumophila sono coltivati ​​in vitro alla fase stazionaria in mezzi liquidi per produrre etichettati 'trasmissive' batteri (Figura 1A). I batteri vengono quindi utilizzati per infettare monostrati di A. castellanii per 18 ore per ottenere una fase avanzata del ciclo di vita intracellulare. Vacuoli di grandi dimensioni contengonobatteri zione può essere visualizzata a questo punto di tempo utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 1A). Protozoi cellule vengono lisate e batteri recuperati dal lisato sono misurati per l'emissione a 512 nm usando un lettore di fluorescenza piastra. Fluorescenza è correlata con la densità ottica per calcolare molteplicità d'infezione (MOI) per l'infezione di cellule bersaglio (Figura 1, Correlazione * Curve). Dopo ore invasione (T ₀₎ e 18 post-invasione (T _18), le cellule bersaglio sono quantificati per la fluorescenza, che rappresenta i batteri intracellulari. Fluorescenza può essere monitorato mediante microscopia e citometria a flusso, e la conta può essere misurata mediante placcatura colonia. Il test di adescamento è sempre accompagnato da infezioni da wild-type L. pneumophila e un ceppo difettosa in Dot / Icm sistema secrezione di tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Ciò fornisce soprattutto controlli interni per i confronti diretti tra wild-type di unnd eventuali ceppi mutanti isogenici utilizzati nel processo di infezione. L'inclusione del ceppo virulento Δ DOTA durante la fase di adescamento imposta una soglia per l'osservazione della crescita attenuati fenotipi associati isogeniche ceppi mutanti che sono coltivate in vitro.