Summary

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em> Drosophila</em> Retinaları

Published: November 14, 2012
doi:

Summary

<em> Drosophila</em> Retina bir basmakalıp şekilde oluşturulan hücre tipleri az sayıda oluşan bir kristal kafes benzeri bir<sup> 1</sup>. Sofistike genetik analizi için onun amenability kompleks gelişim programlarının çalışma sağlar. Bu protokol fotoreseptör farklılaşma odaklanarak, üç ayrı gelişim aşamalarında diseksiyonlarının ve retinanın immunohistokimyasal açıklar.

Abstract

Drosophila melanogaster bileşik göz yaklaşık 750 küçük gözcüklerinin (birim göz) oluşur. Her bir ommatidium lens koni salgılayan hücreler, pigment hücreler, bir kıl hücresi ve sekiz fotoreseptör (PR) R1'in-R8 2 de dahil olmak üzere yaklaşık 20 hücreleri oluşur. PRs ışığa duyarlı pigmentleri, Rhodopsins (RHS) içeren özel microvillar yapıları, rhabdomeres var. Altı PRS rhabdomeres (R1-R6) bir yamuk oluşturur ve RH1 3 4 içerir. R7 ve R8 rhabdomeres yamuk merkezi arka arkaya yerleştirilmiş ve ışık aynı yol paylaşırlar. R7 ve R8, PR stokastik olarak iki ana tipi 5 ST farklı kombinasyonlarını ifade eder: 'p' tipinde, s R7s içinde RH3 p R8s içinde RH5 ile bağlanmaktadır, "y" alt tipinde, y R7s içinde RH4 ile ilişkili iken y RH6 6 7 8 R8s.

PRs ve küçük gözcüklerinin gelişimi erken belirtimi larva göz antennal hayalsel disk, epitel hücre tek tabaka başlar. Farklılaşma dalgası diski 9 genelinde süpürür ve küçük gözcüklerinin 10-11 içine farklılaşmamış hücre montajı başlatır. 'Kurucusu hücre' R8 ilk olarak belirtilen ve R7 12-14 R1-6 ve sonra acemi. Edilir Daha sonra, pupa gelişme sırasında, PR farklılaşma rhabdomere oluşumu, sinaptogenez ve sonunda rh ekspresyonunu içeren kapsamlı morfolojik değişiklikler 15, yol açar.

Bu protokol, biz retina oluşumu ve gelişme yollarını ilgili çeşitli sorular ele uygulanabilir Retina gelişimi üç tanımlandığı dönemlerde, retinal diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Burada, bütün montaj larva, midpupal ve yetişkin retina (içinde tek hücre düzeyinde aşamalı PR farklılaşma görselleştirmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz <s> Şekil 1) Trong.

Protocol

1. Giriş Üçüncü dönem larva, midpupal ve yetişkinlik evresi: Bu video, biz üç tanımlanan gelişimsel dönemlerinde retina diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim protokol aynı zamanda diğer pupa aşamalarında (önceki aşamalarında ilgili ayrıntılar için, 16) için çalışıyor olsa da tek bir odak düzlemli ve onların çekirdekleri tüm PR ve görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi kolayca tanımlanabilir görüntüleme için op…

Discussion

1. Sorun Giderme

Bizim tecrübelerimize göre, diseksiyonlar uygulamada (birkaç haftaya kadar) gerektirir ve masada dirsek ve ön kol bekleterek ve parmak diseksiyon çanak ile temas rahat bir el pozisyonu 21 elde kolaylaştırılmaktadır. Bu şekilde, sadece başparmak, işaret ve orta parmakları ince hareketleri gerçekleştirin.

Fotoreseptörler zarar vermeden lamina Çıkarma muhtemelen en zor adımdır. Lamina kırmızı göz pigmentasyon karşı …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser HY bir Ehrman burs tarafından desteklenmiştir. H., DV, JR bir New York Üniversitesi Dekan Tez CD DJ Bursu, NIH GrantR01 EY13010 ve DFG bursu için RJJ, NIH hibe F32EY016309 Medical Research doktora sonrası dostluk için bir Jane Tabut Childs Memorial Fonu (RI 2208/1- 1). Biz el yazması üzerinde yorum yapmak için Nina Vogt ve Pamela Boodram ederim.

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
  3. O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

Play Video

Cite This Article
Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

View Video