Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em> Drosophila</em> Retine
Summary
Il<em> Drosophila</emRetina> è un reticolo cristallino composto da un piccolo numero di tipi cellulari che sono generati in modo stereotipato<sup> 1</sup>. La sua riconducibilità a sofisticate analisi genetica permette lo studio di complessi programmi di sviluppo. Questo protocollo descrive le dissezioni e immunoistochimica di retina in tre distinte fasi di sviluppo, con particolare attenzione alla differenziazione dei fotorecettori.
Abstract
L'occhio composto di Drosophila melanogaster è composto da circa 750 ommatidi (occhi unità). Ogni ommatidium è composto da circa 20 cellule, inclusa la lente-secernenti coni, cellule del pigmento, una cella a setole e otto fotorecettori (PR) R1-R8 2. Il PRS hanno le strutture di microvillar, le rhabdomeres, che contengono pigmenti sensibili alla luce, i rodopsine (sd). Le rhabdomeres di sei PR (R1-R6) formano un trapezio e contengono Th1 3 4. Le rhabdomeres di R7 e R8 sono posizionati in tandem nel centro del trapezio e condividono lo stesso percorso della luce. R7 e R8 PR stocasticamente esprimono diverse combinazioni di Rhs in due sottotipi principali 5: Nel sottotipo la 'p', in p RH3 R7s è accoppiato con RH5 in p R8s, mentre nel sottotipo del 'y', Rh4 in y R7s è associato RH6 in y R8S 6 7 8.
Prime caratteristiche di PR e sviluppo di ommatidi inizia nella larvale eye-antennali disco immaginale, un monostrato di cellule epiteliali. Un'ondata di differenziazione spazza tutto il disco 9 e avvia l'assemblaggio di cellule indifferenziate in ommatidi 10-11. La R8 'cella fondatore' è specificato prima e recluta R1-6 e poi R7 12-14. Successivamente, durante lo sviluppo pupale, PR differenziazione porta a vasti cambiamenti morfologici 15, tra cui la formazione di rhabdomere, sinaptogenesi e di espressione alla fine rh.
In questo protocollo, si descrivono i metodi per dissezioni retiniche e immunoistochimica in tre periodi definiti di sviluppo della retina, che possono essere applicati per affrontare una serie di questioni concernenti la formazione della retina e percorsi di sviluppo. Qui, usiamo questi metodi per visualizzare la differenziazione graduale PR a livello di singola cellula per intero monte larvale, midpupal e adulti retine ( <sTrong> Figura 1).
Protocol
Discussion
1. Risoluzione dei problemi
Nella nostra esperienza, dissezioni richiedono una pratica (fino a diverse settimane) e sono facilitate da raggiungere una posizione comoda a mano 21 con appoggio i gomiti e gli avambracci sul tavolo e con le dita in contatto con il piatto dissezione. Dita In questo modo, solo il pollice, indice e medio compiere movimenti sottili.
Rimozione della lamina senza danneggiare i fotorecettori è probabilmente il passo più difficile….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio a Ehrman HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund per la borsa di studio post-dottorato di ricerca medica RJJ, NIH Grant F32EY016309 a DV, Fellowship Tesi di New York University di Dean a DJ, NIH GrantR01 EY13010 su CD e una borsa di studio per DFG JR (RI 2208/1- 1). Ringraziamo Nina Vogt e Pamela Boodram per i commenti sul manoscritto.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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