Summary

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em> Drosophila</em> Retinas

Published: November 14, 2012
doi:

Summary

La<em> Drosophila</emRetina> es una red cristalina de tipo compuesto por un pequeño número de tipos de células que se generan de una manera estereotipada<sup> 1</sup>. Su docilidad al análisis genético sofisticado permite el estudio de complejos programas de desarrollo. Este protocolo describe disecciones e inmunohistoquímica de retinas en tres etapas de desarrollo discretos, con un enfoque en la diferenciación de los fotorreceptores.

Abstract

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster se compone de alrededor de 750 omatidios (ojos unitarios). Cada ommatidium se compone de alrededor de 20 células, incluyendo las células secretoras de cono-lente, células de pigmento, una célula de cerdas y ocho fotorreceptores (RP) R1-R8 2. Los BPs tienen estructuras especializadas microvillar, los rhabdomeres, que contienen pigmentos sensibles a la luz, la rodopsina (RHS). Los rhabdomeres de seis rupias (R1-R6) forman un trapecio y contienen Rh1 3 4. Los rhabdomeres de R7 y R8 están situados en tándem en el centro del trapezoide y comparte el mismo camino de la luz. R7 y R8 RP estocásticamente expresan diferentes combinaciones de RHS en dos subtipos principales 5: En el subtipo 'p', p RH3 en R7s se acopla con Th5 en p R8s, mientras que en el subtipo 'y', Th4 en R7s y se asocia con RH6 en y r8s 6 7 8.

Especificación temprana de RP y desarrollo de omatidios comienza en el ojo larval-antenal disco imaginal, una monocapa de células epiteliales. Una ola de diferenciación barre a través del disco 9 e inicia el ensamblaje de células indiferenciadas en ommatidia 10-11. El R8 'célula fundador se especifica primero y recluta R1-6 y R7 12-14. Posteriormente, durante el desarrollo pupal, PR diferenciación conduce a amplios cambios morfológicos 15, incluyendo la formación de rhabdomere, sinaptogénesis y la expresión final rh.

En este protocolo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo de la retina, que se pueden aplicar para abordar una variedad de cuestiones relativas a la formación de la retina y las vías de desarrollo. Aquí, nosotros usamos estos métodos para visualizar la gradual diferenciación PR a nivel de una sola célula en su totalidad larval monte, midpupal retinas y adultos ( <strong> Figura 1).

Protocol

1. Introducción En este vídeo, se describen métodos para disecciones de retina y de inmunohistoquímica en tres períodos definidos de desarrollo: larvas del tercer instar, midpupal y la etapa adulta. Aunque nuestro protocolo también funciona para otros pupa (para más detalles sobre las etapas anteriores, véase 16), se optó por el escenario midpupal, ya que es óptima para todos los RP imágenes en un plano focal y sus núcleos son fácilmente identificables, lo que facilita …

Discussion

1. Solución de problemas

En nuestra experiencia, las disecciones requieren práctica (hasta varias semanas) y son facilitados por lograr una posición cómoda de la mano 21 descansando los codos y los antebrazos sobre la mesa y con los dedos en contacto con la placa de disección. De esta forma los dedos, los pulgares sólo el, índice y medio realizar movimientos sutiles.

Extracción de la lámina sin dañar los fotorreceptores es probablemente el paso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una beca de Ehrman a HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund para la beca de investigación postdoctoral médica a JJR, NIH subvención F32EY016309 a DV, una Beca Universidad de Nueva York Dean Disertación para DJ, NIH EY13010 GrantR01 para CD y una beca de la DFG a JR (RI 2208/1- 1). Damos las gracias a Nina Vogt y Boodram Pamela para comentarios sobre el manuscrito.

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

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Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

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