Summary

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em> Drosophila</em> Netzhäute

Published: November 14, 2012
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Summary

Die<em> Drosophila</em> Netzhaut ist eine kristallartige Gitter aus einer kleinen Anzahl von Zelltypen, die in einer stereotypen Art und Weise erzeugt werden zusammengesetzt<sup> 1</sup>. Seine Eignung für anspruchsvolle genetische Analyse ermöglicht die Untersuchung von komplexen Entwicklungs-Programme. Dieses Protokoll beschreibt Dissektionen und Immunhistochemie von Netzhaut an drei diskrete Entwicklungsstufen, mit einem Fokus auf Photorezeptor Differenzierung.

Abstract

Das Facettenauge von Drosophila melanogaster besteht aus etwa 750 Ommatidien (Einheit Augen). Jeder Ommatidium wird von etwa 20 Zellen, einschließlich Objektiv-sezernierenden Zapfenzellen, Pigmentzellen, einer Borste Zelle und acht Photorezeptoren (PRs) R1-R8 2 zusammen. Die PRs spezialisiert haben microvillar Strukturen, die Rhabdomeren, die lichtempfindliche Pigmente, die Rhodopsine (RHS) enthalten. Die Rhabdomere sechs PRs (R1-R6) ein Trapez bilden und enthalten Rh1 3 4. Die Rhabdomere von R7 und R8 im Tandem in die Mitte des Trapezes positioniert und den gleichen Weg des Lichtes. R7 und R8 PRs stochastisch exprimieren verschiedene Kombinationen von Rhs in zwei Subtypen 5: Im 'p' Subtyp, Rh3 in p R7s mit RH5 in p R8S gekoppelt ist, während in der 'y' Subtyp, Rh4 in y R7s zugeordnet ist Rh6 in y R8S 6 7 8.

Frühe Angabe PRs und Entwicklung Ommatidien beginnt in der larvalen Auge antennalen Imaginalscheibe eine Monoschicht von Epithelzellen. Eine Welle der Differenzierung fegt über die Scheibe 9 und initiiert den Aufbau von undifferenzierten Zellen in Ommatidien 10-11. Die Gründer Zelle R8 wird in erster angegebenen rekrutiert R1-6 und dann R7 12-14. Anschließend, während Puppenentwicklung führt PR Differenzierung umfangreiche morphologische Veränderungen 15, einschließlich rhabdomere Bildung, Synaptogenese und schließlich rh Ausdruck.

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Zeiträume der Netzhaut Entwicklung, die Anwendung auf eine Vielzahl von Fragen Netzhaut Bildung und Entwicklungswege angesprochen werden können. Hier verwenden wir diese Methoden, um die schrittweise PR Differenzierung am Ebene einzelner Zellen in whole mount Larven, midpupal und erwachsenen Netzhaut visualisieren ( <sTrong> Abbildung 1).

Protocol

Ein. Einführung In diesem Video beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Entwicklungszeiten: die dritte Larvenstadium Larvenstadium, das midpupal und die erwachsenen Stadium. Obwohl unser Protokoll auch für andere Puppen Stufen (für Details auf die früheren Stadien, siehe 16), wählten wir die midpupal Bühne, wie es optimal für die Bildgebung ist alles PRs in einer Brennebene und ihre Kerne sind leicht zu identifizieren, die e…

Discussion

Ein. Fehlerbehebung

Nach unserer Erfahrung erfordern Dissektionen Praxis (bis zu mehreren Wochen) und werden durch das Erreichen eine bequeme Handhaltung 21 durch ruhen die Ellenbogen und Unterarme auf den Tisch und mit den Fingern in Kontakt mit der Dissektion Gericht erleichtert. Auf diese Weise wird nur der Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger durchführen subtilen Bewegungen.

Entfernen der Lamina ohne Beschädigung der Photorezeptoren ist wahrscheinli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein Ehrman Stipendium für HY unterstützt. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research Postdoc-Stipendium, um RJJ, NIH Grant F32EY016309 auf DV, ein New York University Deans Dissertation Fellowship DJ, NIH GrantR01 EY13010 auf CD und ein DFG-Stipendium für JR (RI 2208/1- 1). Wir danken Nina Vogt und Pamela Boodram für Kommentare zum Manuskript.

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

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Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

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