נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em> דרוזופילה</em> רשתיות
Summary
<em> דרוזופילה</em> רשתית היא סריג הגבישי דמוי המורכבים ממספר קטן של סוגי תאים שנוצרים באופן סטריאוטיפי<sup> 1</sup>. amenability לניתוח גנטי מתוחכם מאפשר הלימוד של תוכניות התפתחותיות מורכבות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחים ואימונוהיסטוכימיה של רשתית בשלושה שלבי התפתחות נפרדים, עם דגש על בידול photoreceptor.
Abstract
העין המורכבת של דרוזופילה melanogaster מורכב מכ 750 אומטידיה (עיני יחידה). כל אומטידיום מורכב מכ 20 תאים, כולל תאי מפרישי עדשה חרוט, תאי פיגמנט, תאי זיפים ושמונה photoreceptors (PRS) R1-R8 2. הפורטוריקנים יש מבנים מיוחדים, microvillar את rhabdomeres, המכילים פיגמנטים רגישים לאור, את Rhodopsins (RHS). את rhabdomeres של שישה הפורטוריקנים (R1-R6) בצורת טרפז ומכיל Rh1 3 4. את rhabdomeres של R7 ו R8 מוצב במקביל במרכז הטרפז ולשתף אותו הנתיב של אור. R7 והפורטוריקנים R8 stochastically להביע שילובים שונים של RHS בשני תתי סוגים עיקריים 5: בתת סוג 'P', בעמ 'Rh3 R7s היא בשילוב עם Rh5 בעמ R8s, ואילו בתת הסוג "Y", בRh4 y R7s קשור RH6 בy R8s 6 7 8.
מפרט מוקדם של הפורטוריקנים ופיתוח של אומטידיה מתחיל בדיסק זחל עיני מחושים הדמיוני monolayer של תאי האפיתל. גל של בידול חולף על פני הדיסק 9 ויוזם את ההרכבה של תאים לא עברו התמיינות לאומטידיה 10-11. 'תא המייסד' R8 מצוין ראשון ומגייס R1-6 ולאחר מכן R7 12-14. לאחר מכן, במהלך התפתחות גלמים, בידול יחסי הציבור מוביל לשינויים נרחבים מורפולוגיים 15, כולל היווצרות rhabdomere, synaptogenesis וסופו של דבר ביטוי RH.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות מוגדרות של התפתחות רשתית, אשר יכול להיות מיושמות על מנת לטפל במגוון רחב של שאלות הנוגעות להיווצרות רשתית ומסלולי התפתחות. כאן, אנו משתמשים בשיטות אלה כדי להמחיש את בידול יחסי הציבור ההדרגתי ברמת התא בודד בכל הר זחל, midpupal ומבוגרות רשתיות ( <sטרונג> איור 1).
Protocol
Discussion
1. פתרון בעיות
מניסיוננו, נתיחות דורשות תרגול (עד מספר שבועות) והם הקלו על ידי השגת עמדת יד נוחה של 21 על נח את המרפקים ואמות על השולחן ובאצבעות יצירת קשר עם צלחת הניתוח. אצבעות בדרך זו, רק אגודלים, אינדקס ובינוניים לבצע תנועות עד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת Ehrman לח.י.. ח', קרן ג'יין קופין צ'יילדס זיכרון למלגת דוקטורט מחקר רפואית לRJJ, NIH F32EY016309 גרנט לDV, מלגת ניו יורק של דיקן אוניברסיטה לעבודת דוקטור DJ, GrantR01 NIH EY13010 לתקליטור ואחוות DFG לJR (RI 2208/1- 1). אנו מודים לנינה וגט ופמלה Boodram להערות על כתב היד.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
- O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
