Summary

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em>ショウジョウバエ</em>網膜

Published: November 14, 2012
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Summary

ザ<em>ショウジョウバエ</em>網膜は、紋切り型の方法で生成された細胞の種類の数が少ないからなる結晶状格子です<sup> 1</sup>。洗練された遺伝解析への従順は、複雑な発達プログラムの研究を可能にします。このプロトコルは、感光体の分化を中心に、3つの個別の発達段階で解剖し、網膜の免疫組織化学を説明しています。

Abstract

キイロショウジョウバエの複眼は約750 ommatidiumの複数形(ユニット目)から構成されています。それぞれの個眼は、レンズを分泌する錐体細胞、色素細胞、毛細胞と8つの光受容体(PRS)R1〜R8 2を含む約20の細胞で構成されています。 PRSは、特殊な微絨毛構造​​、光に敏感な顔料を含有rhabdomeres、ロドプシンを(RHS)があります。 6 PRのrhabdomeres(R1〜R6)は、台形を形成し、体Rh1 3 4が含まれいます。 R7とR8のrhabdomeresは台形の中心にタンデムに配置され、光の同じパスを共有しています。 R7とR8 PRSは確率的に2メインサブタイプ5のRHSのさまざまな組み合わせを表現: 'p'のサブタイプでは、p R7sでRH3 p R8sでRH5と結合されて、 'y'のサブタイプには、y R7sでRH4が関連付けられているのに対し、 yの R8sでRH6 6 7 8。

PRSとommatidiumの複数形の開発の初期仕様では幼虫の目触角成虫原基は、上皮細胞の単層で始まる。差別化の波は、ディスク9に掃引とommatidiumの複数形10月11日に未分化細胞のアセンブリを開始します。 '創始細胞' R8はR7を12月14日 、第1及び新入社員、R1-6と指定されています。その後、蛹の開発中に、PRの分化は感桿分体形成、シナプス形成し、最終的にrhの発現を含む広範な形態学的変化15につながる。

このプロトコルでは、網膜の形成や発達経路に関するさまざまな問題に取り組むために適用することができる網膜の開発の3つの定義された期間、網膜における解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。ここで、我々は全体のマウント幼虫、midpupalと成人網膜の単一細胞レベルで段階的なPRの分化を視覚化するために、これらのメソッドを使用します( <sチョン·>図1)。

Protocol

1。はじめに三齢幼虫、midpupalと成虫:このビデオでは、3つの定義済みの発達期間における網膜の解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。我々のプロトコルは、他の蛹の段階のために動作しますが(それ以前の段階の詳細については、16を参照)は、1つの焦点面とその核にイメージングのためのすべてのPRに最適であるように、我々は、midpupal舞台を選…

Discussion

1。トラブルシューティング

我々の経験では、解剖の練習(最大〜数週間)が必要で、テーブルの上に、解剖皿に接触して指で肘や前腕を置くことによって快適な手の位置21を達成することによって促進される。そのように、唯一の親指、人差し指と中指が微妙な動きを実行します。

感光体を傷つけることなく薄層を除去することは、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品はHYにEhrmanの交わりによってサポートされていました。 H.、DV、JRにニューヨーク大学ディーンの論文をCDにDJのフェローシップは、NIH GrantR01 EY13010とDFG交わりRJJ、NIHグラントF32EY016309に医学研究ポスドクのためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金(RI 2208/1- 1)。我々は、原稿上のコメントのためのニーナ·フォークトとパメラBoodramに感謝します。

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
  3. O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

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Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

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