No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón
Summary
Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.
Abstract
El sistema linfático vascular es un componente importante del sistema circulatorio que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona la vigilancia inmune, y media la absorción de grasas en el intestino. Sin embargo, a pesar de su función crítica, existe una comprensión relativamente poco de cómo funciona el sistema linfático se adapta a servir a estas funciones en la salud y la enfermedad 1. Recientemente, hemos demostrado la capacidad de la arquitectura dinámicamente imagen linfático y los ganglios "bombeo" acción en sujetos humanos normales, así como en las personas que padecen disfunción linfática mediante la administración de un rastro en el infrarrojo cercano fluorescente (NIRF) colorante y una costumbre, Gen III- intensificado sistema de imágenes 2-4. NIRF imágenes mostraron cambios dramáticos en la arquitectura linfático y la función con la enfermedad humana. Aún no está claro cómo se producen estos cambios y nuevos modelos animales se están desarrollando para dilucidar su base genética y molecular. En este protocolo, se presenta linfático NIRF, salameda animal de formación de imágenes utilizando 5,6 verde de indocianina (ICG), un colorante que se ha utilizado durante 50 años en los seres humanos 7, y un NIRF marcada con colorante cíclico dominio de unión de albúmina (CABD-IRDye800) péptido que se une preferentemente a la albúmina humana y de ratón 8 . Aproximadamente 5,5 veces más brillante que ICG, Abd-IRDye800 tiene un perfil linfático autorización similar y se puede inyectar en dosis más pequeñas de ICG para lograr suficientes señales NIRF para formación de imágenes 8. Debido a que ambos se unen CABD-IRDye800 ICG a la albúmina y en el espacio intersticial 8, ambas pueden representar el transporte de proteínas en activo y dentro de los vasos linfáticos. Intradérmica (ID) inyecciones (l 5-50) de ICG (645 mM) o CABD-IRDye800 (200 mM) en solución salina y se administra a la cara dorsal de cada pata trasera y / o el lado izquierdo y derecho de la base de la cola de un ratón isoflurano anestesia. La concentración de colorante resultante en el animal es 83-1,250 mg / kg de ICG o 113-1,700 mg / kg paraCABD-IRDye800. Inmediatamente después de las inyecciones, las imágenes linfático funcional se lleva a cabo durante un máximo de 1 h usando un personalizado, un animal pequeño NIRF sistema de formación de imágenes. Resolución espacial Whole animales pueden representar los vasos linfáticos fluorescentes de 100 micrones o menos, y las imágenes de las estructuras de hasta 3 cm de profundidad pueden ser adquiridos 9. Las imágenes se adquieren mediante V + software + y analizados mediante el software ImageJ o MATLAB. Durante el análisis, regiones consecutivas de interés (ROIs) que abarca todo el diámetro del recipiente se dibujan a lo largo de un vaso linfático dado. Las dimensiones de cada retorno de la inversión se mantienen constantes para un buque determinado y la intensidad NIRF se mide para cada ROI para evaluar cuantitativamente "paquetes" de linfa en movimiento a través de los vasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizamos una costumbre, un animal pequeño NIRF sistema de imagen para capturar imágenes de los vasos linfáticos marcadas en ratones. Para construir películas de movimiento linfático, 300 o más imágenes se recogen. Para el análisis funcional de los vasos linfáticos de las películas, dos o más regiones de interés son manualmente trazada a lo largo de un vaso linfático. Las dimensiones de las ROIs se mantienen constantes para cada buque y son aproximadamente el diámetro del vaso. Mientras que la resolución…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: a Eva Sevick NIH R01 CA128919 y NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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