Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis
Summary
Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.
Abstract
Het lymfatische vasculaire systeem is een belangrijk onderdeel van de bloedsomloop dat vloeistof homeostase handhaaft, biedt immune surveillance en bemiddelt vetopname in de darm. Ondanks deze kritische functie, is er betrekkelijk weinig begrip van hoe het lymfatisch systeem past zich aan dienen deze functies in gezondheid en ziekte 1. Onlangs hebben we aangetoond over het vermogen om dynamisch beeld lymfatische architectuur en de lymfe "pompen" actie in normale proefpersonen en bij personen die lijden lymfatische dysfunctie met trace toediening van een nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) kleurstof en een aangepaste, Gen III- geïntensiveerd beeldvormingssysteem 2-4. NIRF beeldvorming dramatische veranderingen in lymfatische architectuur en functie toonde met menselijke ziekte. Het blijft onduidelijk hoe deze veranderingen en nieuwe diermodellen zijn ontwikkeld voor de genetische en moleculaire basis te helderen. In dit protocol, presenteren we NIRF lymfatische, small dier imaging 5,6 met indocyanine groen (ICG), een kleurstof die gebruikt 50 jaar bij mensen 7 en een NIRF kleurstof gelabelde cyclische albumine bindend domein (Abd-IRDye800) peptide dat bij voorkeur bindt muis en humaan albumine 8 . Ongeveer 5,5 keer helderder dan ICG, 'Abd-IRDye800 heeft een soortgelijke lymfatische speling profiel en kan worden geïnjecteerd in kleinere doseringen dan ICG om voldoende NIRF signalen te bereiken voor de beeldvorming 8. Omdat beide Abd-IRDye800 en ICG binden aan albumine in de interstitiële ruimte 8, die beide kunnen actief eiwit transport naar en tonen in de lymfevaten. Intradermale (ID) injectie (5-50 ul) van ICG (645 uM) of Abd-IRDye800 (200 uM) in zoutoplossing worden toegediend aan het dorsale aspect van elke achterpoot en / of de linker en rechter zijde van de basis van de staart van een isofluraan-verdoofde muis. De verkregen kleurstof concentratie in het dier 83-1,250 ug / kg voor ICG of 113-1,700 ug / kg voor'Abd-IRDye800. Onmiddellijk na injecties wordt lymfatische functionele beeldvorming uitgevoerd tot 1 uur met een aangepaste, klein dier NIRF beeldvormingssysteem. Hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 100 micrometer of minder, en beelden van structuren tot 3 cm in diepte worden verkregen 9. De beelden werden met behulp van V + + software en geanalyseerd met behulp van ImageJ of MATLAB software. Tijdens de analyse worden opeenvolgende gebieden die van belang (ROI) omvat het gehele vaartuig diameter getrokken langs een bepaalde lymfevat. De afmetingen voor elke ROI constant worden gehouden voor een bepaald vaartuig en NIRF intensiteit wordt gemeten voor elke ROI voor een kwantitatieve beoordeling "pakketten" van lymfe bewegen door schepen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We maken gebruik van een aangepaste, kleine dieren NIRF imaging systeem om beelden van het label lymfevaten in muizen te vangen. Om films van lymfe beweging te construeren, zijn 300 of meer beelden verzameld. Voor functionele analyse van lymfevaten uit films, worden twee of meer ROI's handmatig worden getekend langs een lymfevat. De afmetingen van het ROI worden constant gehouden voor elk vaartuig en ongeveer de diameter van het vat. Terwijl hele dier ruimtelijke resolutie kan afbeelden fluorescent lymfevaten van 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan Eva Sevick: NIH R01 CA128919 en NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
