Summary

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.

Abstract

מערכת כלי דם הלימפה היא מרכיב חשוב של מערכת הדם ששומר על איזון נוזלים, מספקת מעקב חיסוני, ומתווך ספיגת שומן במעיים. ואולם, למרות הפונקציה הקריטית שלו, יש הבנה מועטת יחסית מאיך מערכת הלימפה מסתגלת לשרת פונקציות אלה במחלה ובריאות 1. לאחרונה, יש לנו הפגנתי יכולת ארכיטקטורה דינמית תמונת הלימפה והלימפה פעולה "שאיבה" בבני אדם רגילים, כמו גם באנשים הסובלים תפקוד הלימפה באמצעות ממשל זכר לצבע קרוב אינפרא האדום ניאון (NIRF) ומותאם אישית, Gen-III התעצם מערכת הדמיה 2-4. NIRF ההדמיה הראתה שינויים דרמטיים בארכיטקטורת הלימפה ולתפקד עם מחלה אנושית. עדיין לא ברור כיצד השינויים הללו מתרחשים ומודלים של בעלי חיים חדשים מפותחים כדי להבהיר בסיס הגנטי ומולקולרי שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הלימפה NIRF, שלקניון חית הדמית 5,6 באמצעות indocyanine ירוק (ICG), צבע ששמש במשך 50 שנים בבני אדם 7, ותחום NIRF צבע הכותרת מחזורי אלבומין מחייב (CABD-IRDye800) פפטיד שנקשר מעדיפים עכבר ו8 אלבומין אנושיים . כ 5.5 פעמים בהירות יותר ICG, CABD-IRDye800 יש פרופיל אישור הלימפה דומה וניתן להזריק במינונים נמוכים יותר מאשר ICG להשיג אותות NIRF מספיקים להדמיה 8. מכיוון שגם לאגד CABD IRDye800-ICG ולאלבומין במרחב הבין 8, שניהם יכולים לתאר תחבורת חלבונים פעילה אל ובתוך lymphatics. Intradermal (ID) זריקות (μl 5-50) של ICG (645 מיקרומטר) או CABD-IRDye800 (200 מיקרומטר) בסליין מנוהלות להיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד ימין והשמאל של הבסיס זנב של עכבר isoflurane-מורדם. ריכוז צבע וכתוצאה מכך הוא בעלי החיים 83-1,250 מיקרוגרם / ק"ג לICG או 113-1,700 מיקרוגרם / ק"ג עבורCABD-IRDye800. מייד לאחר זריקות, הדמיה תפקודית הלימפה מתבצעת לתקופה של עד 1 שעה באמצעות מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה. רזולוציה מרחבית חיים שלמה יכולה לתאר את כלי ניאון הלימפה של 100 מיקרון או פחות, ותמונות של מבנים ל3 סנטימטרי עומק ניתן לרכוש 9. תמונות נרכשה באמצעות V + + תוכנה ונותחה באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. במהלך ניתוח, אזורים רצופים של ריבית (Rois) המקיפה את קוטר הכלי כולו נמשכים לאורך כלי הלימפה נתונה. הממדים עבור כל ROI נשמרים קבוע לכלי נתון ועוצמת NIRF נמדד עבור כל ROI כמותית להעריך "מנות" של הלימפה עוברת דרך כלי דם.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים של אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז (יוסטון, טקסס), מחלקה לרפואה ההשוואתית, ומרכז להדמיה מולקולרית לאחר בדיקה ואישור של הפרוטוקול על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי שלהם והשתמשו ועדה (IACUC) או צער בעלי חי ועדה (AWC). <p class="jove_…

Representative Results

דוגמה להדמית הלימפה NIRF בעכברים כאשר ICG או CABD-IRDye800 מוזרק מזהה בבסיס הזנב של עכבר רגיל, מערכת כלי דם הלימפה בין אתר ההזרקה בבסיס הזנב והבלוטות לימפה מפשעתי (LN) צריכה להיות מייד דמיינה. זמן קצר לאחר הזרקה (כמה שניות עד דקות), כלי הלימפ…

Discussion

אנו משתמשים במערכה אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה כדי ללכוד תמונות של כלי הלימפה שכותרתו בעכברים. לבנות סרטים של תנועת הלימפה, 300 או יותר תמונות שנאספו. לניתוח פונקציונלי של lymphatics מסרטים, שתיים או יותר Rois מצויר ידני יחד כלי הלימפה. מידותיו של Rois נשמרות קבועה לכל כלי והן כ הק?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים לאוות Sevick: NIH R01 CA128919 וNIH R01 HL092923.

Materials

Solutions, Reagents, and Equipment Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church & Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Play Video

Cite This Article
Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

View Video