Non invasive d'imagerie optique du système vasculaire lymphatique d'une souris
Summary
Les techniques d'imagerie développées récemment en utilisant la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) peut aider à élucider le rôle du système lymphatique joue dans les métastases du cancer, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies, et d'autres maladies associées lymphatique.
Abstract
Le système vasculaire lymphatique est une composante importante du système circulatoire qui maintient l'homéostasie fluide, assure la surveillance immunitaire, et l'absorption de graisse sert d'intermédiaire dans l'intestin. Pourtant, malgré sa fonction critique, il ya relativement peu de compréhension de la façon dont le système lymphatique s'adapte pour répondre à ces fonctions en matière de santé et de la maladie 1. Récemment, nous avons démontré la capacité de l'architecture dynamiquement l'image lymphatique et de la lymphe "pompage" action sujets humains normaux ainsi que chez les personnes présentant un dysfonctionnement lymphatique en utilisant l'administration trace d'un proche infra-rouge fluorescent (NIRF) colorant et une coutume, Gen III- Système d'imagerie intensifié 2-4. NIRF imagerie ont montré des changements dramatiques dans l'architecture et la fonction lymphatique avec la maladie humaine. Il reste à savoir comment ces changements se produisent et de nouveaux modèles animaux sont développées pour élucider leur base génétique et moléculaire. Dans ce protocole, nous présentons lymphatique NIRF, sanimaux centre d'imagerie utilisant 5,6 vert d'indocyanine (ICG), un colorant qui a été utilisé pendant 50 ans chez l'homme 7, et un NIRF marqué par un colorant cyclique domaine liaison à l'albumine (Abd-IRDye800) peptide qui se lie préférentiellement la souris et l'albumine humaine 8 . Environ 5,5 fois plus brillante que l'ICG, Abd-IRDye800 a un profil similaire lymphatique jeu et peut être injecté dans les petites doses de l'ICG pour atteindre signaux NIRF suffisantes pour l'imagerie 8. Parce que les deux se lient Abd-IRDye800 et ICG à l'albumine dans l'espace interstitiel 8, ils peuvent représenter à la fois le transport des protéines actif dans et à l'intérieur des vaisseaux lymphatiques. Intradermique (ID) injections (ul 5-50) de l'ICG (645 uM) ou Abd-IRDye800 (200 uM) dans une solution saline sont administrés à la face dorsale de chaque patte arrière et / ou sur le côté gauche et droit de la base de la la queue d'une souris anesthésiée isoflurane. La concentration du colorant résultant de l'animal est 83-1,250 mg / kg pour le GIC ou 113-1,700 mg / kg pourAbd-IRDye800. Immédiatement après les injections, imagerie fonctionnelle lymphatique est réalisée pendant 1 h en utilisant un personnalisé, petit animal NIRF système d'imagerie. Résolution spatiale animal entier peut représenter vaisseaux lymphatiques fluorescentes de 100 microns ou moins, et les images des structures jusqu'à 3 cm de profondeur peut être acquis 9. Les images sont acquises à l'aide du logiciel V + + et analysées en utilisant le logiciel MATLAB ou ImageJ. Pendant l'analyse, régions consécutives d'intérêt (ROI) englobant le diamètre du vaisseau entier sont attirés le long d'un vaisseau lymphatique donnée. Les dimensions de chaque ROI sont maintenus constants pour un navire donné et l'intensité NIRF est mesurée pour chaque ROI d'évaluer quantitativement «paquets» de la lymphe se déplaçant à travers les vaisseaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous utilisons une coutume, petit animal NIRF système d'imagerie pour capturer des images de vaisseaux lymphatiques marquées chez la souris. Pour construire films de mouvement lymphe, plus de 300 images sont recueillies. Pour l'analyse fonctionnelle des vaisseaux lymphatiques de films, deux ou plusieurs ROIs sont manuellement tirée le long d'un vaisseau lymphatique. Les dimensions de la ROI sont maintenues constantes pour chaque navire, et sont à peu près au diamètre de la cuve. Bien que la résolution…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à Eva Sevick: NIH R01 CA128919 et les NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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