Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus
Summary
Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.
Abstract
Das lymphatische Gefäßsystem ist ein wichtiger Bestandteil des Kreislaufsystems, die Flüssigkeitshomöostase unterhält, bietet Immunüberwachung und vermittelt Fettaufnahme im Darm. Doch trotz seiner kritischen Funktion gibt es vergleichsweise wenig Verständnis dafür, wie das lymphatische System passt sich diese Funktionen in Gesundheit und Krankheit 1 dienen. Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, dynamisch image lymphatischen Architektur und Lymphe "Pumpen"-Aktion in normalen menschlichen Probanden sowie Personen, die unter lymphatischen Funktionsstörungen mit trace Verabreichung einer Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Farbstoff und eine benutzerdefinierte gezeigt, Gen III- intensiviert Bildgebungssystem 2-4. NIRF Bildgebung zeigten dramatische Veränderungen in den lymphatischen Architektur und Funktion mit menschlichen Krankheiten. Es bleibt unklar, wie sich diese Veränderungen auftreten und neue Tiermodelle entwickelt, um ihre genetischen und molekularen Grundlagen aufzuklären. In diesem Protokoll präsentieren wir NIRF Lymph-, sMall tierischen Bildgebung mit 5,6 Indocyaningrün (ICG), ein Farbstoff, der für 50 Jahre bei Menschen 7 verwendet wurde, und eine NIRF Farbstoffmarkiertes cyclischen Albumin-Bindungsdomäne (CABD-IRDye800) Peptid, vorzugsweise an Maus und Human-Albumin 8 . Etwa 5,5 mal heller als ICG hat Abd-IRDye800 eine ähnliche lymphatischen Lichtraumprofil und kann in kleineren Dosen als ICG ausreichende NIRF Signale für bildgebende 8 zu erreichen injiziert werden. Da sowohl Abd-IRDye800 und ICG binden an Albumin im interstitiellen Raum 8, können sie sowohl aktive Protein-Transport in die und innerhalb der Lymphgefäße darstellen. Intradermale (ID) Injektionen (5-50 ul) von ICG (645 pM) oder CABD-IRDye800 (200 pM) in Kochsalzlösung werden dorsal jedes Hinterpfote und / oder der linken und rechten Seite der Basis des verabreichten Schwanz eines Isofluran-Narkose Maus. Die resultierende Farbstoffkonzentration im Tier ist 83-1,250 ug / kg für ICG oder 113-1,700 ug / kg für'Abd-IRDye800. Unmittelbar nach Injektionen, wird die funktionale lymphatischen Bildgebung für bis zu 1 Stunde mit Hilfe einer angepassten, kleines Tier NIRF Imaging-System durchgeführt. Ganztier räumliche Auflösung darstellen kann fluoreszierenden Lymphgefäßen von 100 Mikron oder weniger, und Bilder von Strukturen bis zu 3 cm tief erworben 9 werden. Die Bilder werden aufgenommen mit V + +-Software analysiert und mit ImageJ oder MATLAB-Software. Während der Analyse werden aufeinander Regions of Interest (ROI), die die gesamte Gefäßdurchmesser entlang einer vorgegebenen Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen für jeden ROI konstant gehalten werden für ein bestimmtes Schiff und NIRF Intensität für jeden ROI gemessene die quantitative Erfassung "Pakete" von Lymphe Bewegen durch Gefäße.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir verwenden eine benutzerdefinierte, kleines Tier NIRF Imaging-System, um Bilder von markierten Lymphgefäße in Mäusen zu erfassen. Um Filme von Lymphe Bewegung konstruieren, sind 300 oder mehr Bilder gesammelt. Zur funktionellen Analyse der Lymphbahnen aus Filmen, werden zwei oder mehr ROIs manuell entlang einer Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen des ROIs konstant gehalten werden für jedes Schiff sind und etwa den Durchmesser des Gefäßes. Während ganze Tier räumliche Auflösung fluoreszierende Lymphgefäße…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 CA128919 und NIH R01 HL092923: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an Eva Sevick unterstützt.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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