Summary

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.

Abstract

Il sistema vascolare linfatico è un componente importante del sistema circolatorio che mantiene l'omeostasi fluido, fornisce la sorveglianza immunitaria, e media l'assorbimento di grassi nell'intestino. Eppure, nonostante la sua funzione critica, non vi è la comprensione relativamente poco di come il sistema linfatico si adatta a servire queste funzioni in materia di salute e malattia 1. Recentemente, abbiamo dimostrato la capacità di architettura dinamica linfatica immagine e linfa azione "pompaggio" in soggetti umani normali e anche a persone che soffrono di disfunzione linfatica mediante somministrazione traccia di un vicino infrarosso fluorescente (NIRF) colorante e un costume, Gen III- intensificata sistema di imaging 2-4. NIRF di imaging hanno mostrato cambiamenti drammatici in architettura linfatica e la funzione con la malattia umana. Non è ancora chiaro come questi cambiamenti si verificano e di nuovi modelli animali che sono in fase di sviluppo per chiarire la loro base genetica e molecolare. In questo protocollo, presentiamo linfatico NIRF, small animale Imaging 5,6 utilizzando verde indocianina (ICG), un colorante che è stato usato per 50 anni nell'uomo 7, e un colorante marcato NIRF ciclico dominio di legame (CabD-IRDye800) peptide che si lega preferenzialmente topo e albumina umana 8 . Circa 5,5 volte più luminoso di ICG, 'Abd-IRDye800 ha un profilo simile gioco linfatico e può essere iniettato in piccole dosi di ICG per ottenere segnali NIRF sufficienti per l'imaging 8. Poiché sia bind 'Abd-IRDye800 e ICG all'albumina nello spazio interstiziale 8, entrambi possono descrivere trasporto attivo le proteine ​​in e nei vasi linfatici. Intradermica (ID) iniezioni (microlitri 5-50) di ICG (645 uM) o CabD-IRDye800 (200 pM) in soluzione salina sono somministrati al dorso di ciascuna zampa posteriore e / o il lato sinistro e destro della base del coda di un topo anestetizzato-isoflurano. La concentrazione di colorante conseguente animale è 83-1,250 mcg / kg per ICG o 113-1,700 mg / kg per'Abd-IRDye800. Subito dopo le iniezioni, l'imaging funzionale linfatico è condotto per un massimo di 1 ora con un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF imaging. Risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, e le immagini di strutture fino a 3 cm di profondità possono essere acquisite 9. Le immagini sono acquisite in V + software + e analizzati utilizzando il software ImageJ o MATLAB. Durante l'analisi, consecutivi regioni di interesse (ROI) comprende l'intero diametro nave sono disegnati lungo un vaso linfatico dato. Le dimensioni di ogni ROI sono mantenute costanti per un determinato peschereccio e intensità NIRF è misurato per ciascuna ROI per valutare quantitativamente "pacchetti" di linfa si muove attraverso le navi.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme della University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Dipartimento di Medicina comparativa, e Centro di Imaging Molecolare dopo l'esame e l'approvazione del protocollo da parte loro rispettivi Cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) o il benessere degli animali Committee (AWC). 1. Preparazione del 24 Hr Animali Prima di Imaging La procedura che segue d…

Representative Results

Esempio di Imaging linfatico NIRF in Mouse Quando ICG o CabD IRDye800-ID viene iniettato alla base della coda di un topo normale, la vascolarizzazione linfatica tra il sito di iniezione alla base della coda e il linfonodo inguinale (LN) dovrebbe essere immediatamente visualizzata. Poco dopo l'iniezione (pochi secondi o minuti), il vaso linfatico tra la LN inguinale e ascellare LN deve essere visualizzato come visibile in figura 2. Poiché i linfatici nei topi variano da un …

Discussion

Usiamo una consuetudine, piccolo sistema animale NIRF immagini per catturare immagini di vasi linfatici etichettati nei topi. Per costruire film di circolazione linfatico, 300 o più immagini sono raccolte. Per l'analisi funzionale dei vasi linfatici da film, ROI due o più sono disegnata a mano lungo un vaso linfatico. Le dimensioni della ROI sono mantenute costanti per ciascun recipiente e sono approssimativamente il diametro del vaso. Mentre risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da i seguenti aiuti a Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.

Materials

Solutions, Reagents, and Equipment Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church & Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

References

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Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

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