غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب
Summary
قد وضعت مؤخرا تقنيات التصوير باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة مضان (NIRF) المساعدة في الكشف عن دور الجهاز الليمفاوي ورم خبيث يلعب في السرطان، والاستجابة المناعية، وإصلاح الجرح، وغيرها من الأمراض المرتبطة اللمفاوية.
Abstract
الأوعية الدموية اللمفية هو عنصر هام من عناصر جهاز الدورة الدموية التي تحافظ على التوازن السائل، ويوفر المراقبة المناعي، وتتوسط امتصاص الدهون في الأمعاء. لكن على الرغم من وظيفتها الجوهرية، هناك فهم قليل نسبيا لكيفية تكيف الجهاز اللمفاوي لخدمة هذه الوظائف في الصحة والمرض 1. مؤخرا، لقد أثبتنا القدرة على حيوي صورة العمارة اللمفاوي والليمفاوية "ضخ" العمل في مواضيع الإنسان العادي وكذلك في الأشخاص الذين يعانون ضعف اللمفاوي باستخدام إدارة أثر للصبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) الفلورسنت والعادة، الجنرال III- تكثيف نظام تصوير 2-4. وأظهرت NIRF التصوير تغييرات جذرية في بنية ووظيفة اللمفاوية مع الأمراض التي تصيب البشر. يبقى من غير الواضح كيف أن هذه التغيرات تحدث ويتم تطوير نماذج حيوانية جديدة لتوضيح أساس الجينية والجزيئية. في هذا البروتوكول، نقدم NIRF اللمفاوي، قمول التصوير باستخدام الحيوانات 5،6 خضرة الإندوسيانين (ICG)، وهي الصبغة التي استخدمت لمدة 50 عاما لدى البشر 7، وصبغ المسمى NIRF دوري المجال ملزمة الزلال (CABD-IRDye800) الببتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي الماوس و 8 الألبومين البشري . ما يقرب من 5.5 مرات أكثر إشراقا من ICG، CABD-IRDye800 لديه إزالة اللمفاوي مماثلة الشخصي ويمكن حقن جرعات أقل من في ICG لتحقيق إشارات كافية للتصوير NIRF 8. لأن كلا من ربط CABD-IRDye800 وICG لالزلال في الفضاء الخلالي 8، كلاهما قد تصور بالموقع النقل والبروتين إلى داخل الأوعية اللمفاوية. تدار داخل الأدمة (ID) الحقن (5-50 ميكرولتر) من ICG (645 ميكرومتر) أو CABD-IRDye800 (200 ميكرومتر) في المياه المالحة إلى الجانب الظهري من كل مخلب هند و / أو الجانب الأيسر والأيمن من قاعدة ذيل ماوس isoflurane-تخدير. تركيز صبغة مما أدى إلى الحيوان هو 83-1،250 ميكروغرام / كغ للICG أو 113-1،700 ميكروغرام / كغ للCABD-IRDye800. مباشرة بعد الحقن، ويجري التصوير الوظيفي للموارد البشرية اللمفاوي 1 حتى باستخدام صغيرة مخصصة نظام التصوير NIRF الحيوان. يمكن كله القرار الحيوان المكانية تصوير الأوعية اللمفاوية الفلورسنت من 100 ميكرون أو أقل، وصور الهياكل يصل إلى 3 سم في عمق يمكن الحصول عليها 9. يتم الحصول على الصور باستخدام برنامج V + + وتحليلها باستخدام برامج MATLAB أو يماغيج. أثناء التحليل، يتم رسمها المناطق متتالية من الفائدة (رويس) يشمل القطر بأكمله على طول السفينة سفينة الليمفاوية معين. يتم الاحتفاظ الأبعاد لكل ROI المستمر لسفينة معينة وكثافة NIRF يتم قياس العائد على الاستثمار لكل إجراء تقييم كمي "الحزم" من خلال الأوعية الليمفاوية تتحرك.
Protocol
Representative Results
Discussion
نستخدم صغيرة مخصصة نظام التصوير الحيوان NIRF لالتقاط الصور من الأوعية الليمفاوية وصفت في الفئران. أفلام لبناء الحركة الليمفاوية، يتم جمع 300 أو أكثر الصور. لمفاوية من التحليل الوظيفي من الأفلام، ويتم رسمها يدويا رويس اثنين أو أكثر على طول سفينة الليمفاوية. يتم الاحتفاظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المنح التالية لSevick إيفا: NIH R01 R01 CA128919 وNIH HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
