Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

1. Yapay Balgam Orta hazırlanması (ASM) Birkaç saat bir süre içinde çok yavaş balığı sperm 250 ml steril su ile 4 g DNA ekleyin. DNA eritilip birkaç saat sürer ve oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılmıştır edilebilir. Musin tamamen eriyene dek domuz mide (tip II) yavaş yavaş 250 ml steril su ile 5 g musin ekleyin. Solüsyonu 4 'de bir gece karıştırıldı edilebilir ° C. 100 ml steril su içinde, L-tirozin ve L-sistein hariç olmak üzere, her bir temel ve gerekli olmayan L-amino asit 0,25 g eritilir. 0.5 M potasyum hidroksit 25 ml steril su içinde L-tirozin (M r 56,11 g / mol) ve 0.25 g, 25 mL L-sistein 0.25 g eritilir. 5.9 mg diethylenetriaminepentaacetic asit (DTPA), steril su, 100 ml KCl 5 g NaCl ve 2.2 g eritilir. Bir şişe içinde 1 litrelik DNA, musin, L-amino asitleri, DTPA, NaCl ve KCl birleştirir. Yumurta sarısı e 5 ml ekleE mulsion ve steril su ile yaklaşık 850 ml dolgu. 1 M Tris (pH 8.5; M r 121,14) ile 6.9 pH ayarlayın ve steril su ile hacmi 1 litre getirmek. Sırasıyla 0.22 um ve 45 mm'lik bir gözenek büyüklüğü ve boyun ile Vacuubrand ME 2 diyaframlı vakum pompası ve Millipore Steritop filtre birimleri kullanılarak süzme yoluyla sterilize ASM. Her Steritop filtre ünitesi, üç kez hemen yeniden kullanılabilir, ancak, filtreler yeniden kullanım önce steril su ile iki kere durulanmış gerekir. Filtrasyon işlemi yavaştır ve 2 gün boyunca gerçekleştirilebilir. ASM diğer sürümleri yerine, olası ilaç etkileşimleri nedeniyle filtrasyon Ancak 11, antibiyotik ilavesi kullanan geliştirilmiş olup, bu özel uygulama için yöntem önermiyoruz. Süzülmeden ve ASM süzüldü karanlıkta 4 ° C de muhafaza edilmelidir. Taze ASM kullanılması ancak tavsiye edilir, bu bir ay için maksimum bu şartlar altında tutulabilir. </li> 2. Planktonik Sesil Hücre Asgari Metabolik İnhibitör Konsantrasyon (PSMIC) Belirlenmesi 15 planktonically yetiştirilen P. için minimum metabolik inhibitör konsantrasyon (PSMIC) değerlerini belirlemek için aeruginosa izolatları, ANKEM BSAC 12 İngiliz Derneği kuralları açıklandığı gibi mikrodilüsyon yöntemi, yapılmalıdır. Tercih antibiyotik, bu durumda tobramisin sülfat içinde, seri antibiyotik konsantrasyonları arasında uygun bir aralık sağlamak üzere bir 96-kuyucuklu mikrotitre plaka Luria-Bertani (LB) ortam içinde seyreltilir. P. gecede kültürleri sulandırınız 0,05 bir OD 600 LB in aeruginosa (± 0.01) ve seri olarak seyreltilmiş 100 ul antibiyotik içeren 96 kuyucuklu mikrotitre plaka kuyucuklara hacim 100 ul ilave edin. 0.5 mg / ml – bu durumda, tobramisin sülfat nihai konsantrasyonu 512 arasında değişmektedir. Sekiz her antib tekrarlanmakiotic konsantrasyonu yapılmalıdır. Her izolat için negatif kontrol kuyuları hiçbir antibiyotik ilave edildiği, kurulmalıdır. Ayrıca, sekiz kuyu aşağı analizi sırasında boş olarak kullanılması (Bölüm 2.6) sadece LB içermelidir. (5% O 2,% 10 CO 2, ve% 85 N 2) ya da mikroaerofilik aerobik şartlar altında çalkalama olmadan 37 ° C'de 2 gün – 1 için 96-kuyucuklu mikrotitre inkübe. Mikroaerofilik koşulları büyük anaerobik kavanoz içinde CampyGen gaz üretim paketleri kullanılarak elde edilir. İnkübasyondan sonra, bakteriyel bir büyüme Fluostar omega mikroplaka okuyucu ve MARS Veri analiz yazılımı kullanılarak 600 nm dalga boyunda her bir yanı içerisinde bakteriyel kültür absorbans ölçümüyle belirlenmiştir. Antibiyotik ile tedavi edilen planktonik kültürler (A antibiyotik tedavi planktonik hücreler) ve negatif kontrol (A negatif kontrol) gelen emilim Absorpsiyon çıkarma tarafından düzeltilmesi gerekmektedirSadece kuyular içeren LB (boş) elde edilen arka absorbans iyon. Canlılık yüzdesi inhibisyonu sonradan x% 100 (A antibiyotik tedavi planktonik hücreler anlamına / A negatif kontrol ortalama) olarak hesaplanmıştır. PSMIC 90 planktonik bakteri büyümesini% 90 inhibisyonuna neden olan antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır. Tercih edilen bir antibiyotik, 10 ul% 0.02 (v / v) resazurin (damıtılmış suda seyreltildi) her bir oyuğa ilave edilir ve plaka 1 için aerobik şartlar altında kuluçkaya yatırılır tedavisinden sonra bakteriyel yaşayabilirliği belirlemek için – 37 ° de 2 saat C, 150 devirde ise sarsıntılı. Canlı hücreler pembe floresan resorufin forma mavi resazurin boya azaltacaktır. Resazurin ile inkübasyondan sonra, her bir kuyunun 540 nm dalgaboyu ve Fluostar Omega mikroplaka okuyucuda 590 nm emisyon dalga boyu kullanarak floresan izlemek. Olduğu tarif edildiği gibi veriler analiz edilmelidirdüşük. 3. Biyofilm Sesil Hücre Minimum İnhibitör Konsantrasyon Tayini (BSMIC) P. Gecelik kültürleri aeruginosa (bu durumda, P. aeruginosa 15 izolatı kullanılmaktadır) ,05 bir OD 600 (± 0.01), taze ASM daha sonra daha da seyreltilmiş 1:100 LB içinde seyreltilmiş edilmelidir (toplam hacim 1.8 ml) eklenmiştir. Seyreltilmiş kültürleri (1.8 ml) bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası muamele her oyuğa ilave edilmelidir. Üç kuyular sadece aşağı analizi sırasında boş (Bölüm 3.9) olarak kullanılmak üzere ASM içermelidir. 75 rpm'de çalkalama ise, 37 ° C'de aerobik şartlar altında veya mikroaerofilik 3 gün için laboratuar parafilm ve inkübe ile 24-kuyucuklu plaklar sabitlemek. Mikroaerofilik koşulları büyük anaerobik kavanoz içinde CampyGen gaz üretim paketleri kullanılarak elde edilmelidir. Taze uygun bir konsantrasyon aralığı sağlamak için, bu durumda tobramisin sülfat içinde, tercih antibiyotik sulandırınızASM. 1 mcg / ml – Bu durumda, nihai konsantrasyonu 512 arasında değişmekteydi. 24-kuyucuklu plak uygun kuyulara, 200 ul hacimde, antibiyotik konsantrasyonu, her ekleyin. Dört her bir antibiyotik konsantrasyonu çoğaltır yapılmalıdır. Tercih edilen bir antibiyotik maruz kalmaz Biyofilmler bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. 75 rpm çalkalanırken, 37 bir daha 24 saat aerobik veya mikroaerofilik koşulları ° C altında laboratuar parafilm ve inkübe ile 24-iyi plakaları sabitleyin. Tercih edilen bir antibiyotik varlığında inkübasyondan sonra, 100 ul 100 mg / ml selülaz (0.05 M sitrat tamponu içinde seyreltilir [9,6 g / l Citrate.H NaOH ile su ve pH 2 0-4,6] kullanılarak bakteri biyofilmler bozabilir 1 saat boyunca 150 rpm'de çalkalama ederken) ile, 37 ° C'de aerobik şartlar altında 24-kuyucuklu plaklar inkübe edilir. Gerekirse, biyofilm daha bu aşamada el pipetleme tarafından bozulmuş olabilir. Metabolik faaliyetleri belirlemek içinkesintiye biyofilmler salınan bakteriyel hücrelerinin,% 0.02 100 ul (v / v) resazurin (damıtılmış su ile seyreltilir) 24-kuyucuklu plaklar, her oyuğa ilave edilmesi ve 1 inkübe – 37 ° C 'de 2 saat , 150 devirde ise sarsıntılı. Resazurin ile inkübasyondan sonra, her bir kuyunun 540 nm dalgaboyu ve Fluostar Omega mikroplaka okuyucu ve MARS Veri Analiz Yazılım yılında 590 nm emisyon dalga boyu kullanarak floresan ölçmek. Antibiyotik ile tedavi edilen biyofilm (F antibiyotik ile tedavi edilen biyofilm) ve negatif kontrol (F negatif kontrol) gelen floresans gelen Floresans ASM içeren kuyulardan elde edilen eşiğe çıkarılması ile düzeltilmelidir sadece (F boş). Canlılık yüzdesi inhibisyonu sonradan x% 100 (F antibiyotik tedavi biyofilmlerin anlamına / F negatif kontrol ortalama) olarak hesaplanmıştır. BSMIC 90 antibiyotik olarak tanımlanırtik konsantrasyonu metabolik aktivite% 90 inhibisyon neden olur. 4. Temsilcisi Sonuçlar ASM biyofilm küçük (2 ml) bir hacim içinde mevcuttur ve biyofilmler tam olarak 3 gün (Şekil 1A) içinde oluşturulmaktadır. Bu titizlikle bozmaya zor olmalı biyofilm, pipet ile ortaya konabilir. Mikrokoloniler geniş hacimli 4 (Şekil 1B) yetiştirilen kıyaslanabilir. Şekil 2 elektron mikroskobik görüntü analizi ile tespit olarak planktonically ve biyofilm yetiştirilen hücreler arasında önemli farklılıklar göstermektedir. Biyofilm kültürlerin açıkça biyofilm içindeki hücrelerin ve bireysel yapıları çevreleyen hücre dışı matriks ciddi düzeyde tespit etmek zordur göstermektedir. Çeşitli çalışmalarda biyofilm yaşam tarzı antimikrobiyal duyarlılık 13, 14 etkileyebileceğini düşündürmektedir. Bizim küçük ölçekli ASM assay Dete için kullanılabilirAynı anda birden izolatı için birden çok antibiyotik BSMIC rmine. Assay of akışı Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bakteriyel hücre canlılığı üzerinde antibiyotik etkisi resazurin deneyi kullanılarak ölçülebilir. Antibiyotikler, bu durumda tobramisin içinde kurulmuştur biyofilm eklenebilir ve 24 saat süre ile inkübe edilir. Bu biyofilm bozulur ve resazurin eklendikten sonra. Metabolik olarak aktif hücreleri pembe (resorufin) 15 ila mavi (resazurin) bir renk değişimi ile sonuçlanan resazurin boya azaltabilir. Şekil 4A bir örnek deney gösterir ki içinde P. aeruginosa, bir mikrotitre plakası içinde biyofilm bozulması ve resazurin ilavesinden önce tobramisin farklı konsantrasyonları ile inkübe edildi. Canlı hücreler pembe floresan formu, resorufin için boya azaltmak ise mavi floresan olmayan renk, cansız hücreleri gösterir. SMIC sonra yüzde içine floresans dönüştürerek hesaplanabilirbakteriyel canlılığı kalan. Şekil 4B artan tobramisin konsantrasyonu% canlılığı değişiklik gösterir. % 10 canlılığı SMIC 90 hesaplamak için bir cut-off olarak seçildi. Aerobik koşullar altında, tobramisin SMIC 90 değerleri planktonik kültürleri daha bir biyofilm olarak yetiştirilen hücreler daha yüksektir. Tablo 1 test edilen bütün suşlar için PSMIC 90 ve BSMIC 90 değişimini göstermektedir. LB (planktonik modu) göre ASM (biyofilm modu) yetiştirilen aerobik koşullarda, tobramisin direnç dramatik bir artış (2 SMIC de> 32 kat artış) en izolatlarının gözlendi Tablo 2 gösterir. Aerobik şartlar altında yetiştirilen biyofilmler göre ek olarak, mikroaerofilik koşullar altında yetiştirilen biyofilmler 2 ila> 128-kat bir artış SMIC sergiledi. Şekil1. ASM P. P. aeruginosa biyofilm aeruginosa suşu PAO1 ASM yetiştirilen makroskopik görünür kümeleri (mikrokoloniler) oluşturur. vidalı kapaklı cam şişeler Duran. B, 2 ml ASM kültürlerde Biyofilm oluşumu (7 gün büyüme sonra 30 ml ASM kültürlerinde A, Biyofilm oluşumu (büyük ölçekli) küçük ölçekli) 24-iyi polistiren levhalar 3 gün büyüme sonrası. Şekil 2. ASM biyofilmlerin TEM mikrografları A / C TEM mikrografı; PAO1 (x 27,000) PAO1grown planktonik B / D TEM mikrografı (x57, 000), sırasıyla, planktonically ve ASM yetiştirilen ve ASM sırasıyla. Planktonically yetiştirilen bakteriler LB broth geceleme yetiştirildi. Biyofilmler 30 ml ASM kültürlerde 7 gün süre ile yetiştirildi. Siyah oklar biyofilm içindeki hücrelere başvuran ve yıldızlar ekstraselüler boşluk bakın. Ölçek çubukları = 1um. Şekil 3. ASM biyofilm antimikrobiyal duyarlılık testinin İş Akışı. Şekil 4. Bakteri hücreleri, farklı bir antibiyotik konsantrasyonları ve kalan metabolik aktivite resazurin kullanılarak belirlendi ile inkübe edildi antibiyotik duyarlılığının belirlenmesi için resazurin kullanımı. A, resazurin bir mavi floresan olmayan okside formu cansız hücreleri göstermektedir ve metabolik azalır pembe floresan resorufin. B aktif hücreleri, Floresans şiddeti kalan bakteriyel canlılık yüzdeleri dönüştürülür. % 10 canlılığı MSMIC90 hesaplamak için cut-off olarak seçildi. lar görmek için buraya tıklayınger rakam. </span> Suşları PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1 Aerobik Mikroaerofilik 2 Aerobik Mikroaerofilik 2 PAO1 4 4 8 > 512 Fenerbahçe Salgın Strain (LES) izole LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Sigara LES izolatların 49461 16 32 16 > 512 59032 0.5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tablo 1. Tobramisin için P. aeruginosa Duyarlılıkları. PSMICs ve BSMICs tobramisin belirlenmesi için 1 2-kat seri seyreltiler kullanılmıştır 512 arasında değişen – 0.5 mg / ml (n = her bir konsantrasyonu için 8) ve 512-1 ug / ml (n = 4 her biri için konsantrasyon), sırasıyla;; PSMICs standardı kullanılarak belirlenmiştir mikrodilüsyon yöntemi 1. 2 mikroaerofilik koşullarda% 5 O 2,% 10 CO 2, ve% 85 N 2 idi. Zorlanma PSMIC 90 / BSMIC 90 katlık değişime 1 PSMIC aerobik → PSMIC mikroaerofilik BSMIC aerobik → BSMIC mikroaerofilik PSMIC aerobik → BSMIC aerobik Mikroaerofilik PSMIC → BSMIC mikroaerofilik PAO1 0 > 64 2 128 LES izole LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0.25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Sigara LES izolatların 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0.5 > 32 45 2 > 128 0.25 > 16 Tablo 2. PSMICs ve tobramisin için BSMICs ve Katlama değişikliği. Belirlenmediği 1 ND; kalın değerleri SMIC kat değişiklikler> 10 gösterir.