Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

1. Preparação do meio de escarro Artificial (ASM) Adicionar 4 g de DNA do esperma de peixe para 250 ml de água estéril muito lentamente ao longo de um período de várias horas. O DNA leva várias horas para dissolver completamente e pode ser agitada durante a noite à temperatura ambiente. Adicionar 5 g de mucina de porco estômago (tipo II) lentamente a 250 ml de água estéril até que a mucina se dissolveu completamente. A solução pode ser agitada durante a noite a 4 ° C. Dissolve-se 0,25 g de cada essenciais e não essenciais ácido L-amino, com a excepção de L-tirosina e L-cisteína, em 100 ml de água estéril. Dissolve-se 0,25 g de L-cisteína em 25 ml de hidróxido de potássio 0,5 M (M r 56,11 g / mol) e 0,25 g de L-tirosina em 25 ml de água estéril. Dissolve-se 5,9 mg de ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA), 5 g de NaCl e 2,2 g de KCl em 100 ml de água estéril. Combinar o DNA, mucina, L-aminoácidos, DTPA, NaCl e KCl num frasco de 1 litro. Adicionar 5 ml de gema de ovo emulsion e encha até cerca de 850 ml com água estéril. Ajustar o pH a 6,9 com Tris 1 M (pH 8,5; M r 121,14) e levar o volume de 1 litro com água estéril. Esteriliza-se o ASM por filtração usando um VACUUBRAND ME 2 bomba de vácuo diafragma e unidades Millipore Steritop de filtro com um poro de tamanho e do pescoço de 0,22 e 45 mm, respectivamente. Cada unidade de filtro Steritop pode ser re-utilizado imediatamente até três vezes, no entanto, os filtros têm de ser lavadas duas vezes com água estéril antes da sua reutilização. O processo de filtração é lento e pode ser realizada durante 2 dias. Outras versões da ASM foram desenvolvidos que usam a adição de antibióticos, em vez de filtração 11 No entanto, devido a possíveis interações medicamentosas, não recomendamos o método para esta aplicação em particular. Não filtrada e filtrada ASM devem ser armazenadas a 4 ° C no escuro. Usando ASM fresco é recomendado no entanto, pode ser mantida sob estas condições durante um período máximo de um mês. </li> 2. Determinação da Célula Sessile Concentração Inibitória Mínima Planktonic metabólica (PSMIC) Para determinar a concentração inibitória mínima metabólica (PSMIC) valores para 15 p planktonically crescido aeruginosa, o método de microdiluição deve ser realizada, como descrito nas orientações da British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12. O antibiótico de escolha, neste sulfato de tobramicina caso, é diluído em série em meio Luria-Bertani (LB) meio de uma placa de 96 poços de microtitulação para proporcionar uma gama adequada de concentrações de antibiótico. Diluir as culturas durante a noite de P. aeruginosa em LB para uma densidade óptica 600 de 0,05 (± 0,01) e adicionar 100 volumes ul às cavidades da placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 uL do antibiótico diluídas em série. Neste caso, as concentrações finais de tobramicina sulfato variou entre 512-0,5 ug / ml. Oito repetições de cada antibconcentração iotic deve ser realizada. Poços de controlo negativo para cada isolado deve ser criado, em que nenhum antibiótico é adicionado. Além disso, oito poços deve conter LB apenas para utilização como um branco durante a análise de jusante (Secção 2.6). Incubar as placas de 96 poços de microtítulo durante 1 – 2 dias a 37 ° C sem agitação em condições aeróbias ou microaerófilos (5% de O 2, 10% de CO 2, e 85% de N 2). Microaerofilia são obtidos utilizando embalagens de gás CampyGen geração em grandes jarras de anaerobiose. Após a incubação, o crescimento bacteriano é determinada medindo a absorvância da cultura bacteriana em cada poço a um comprimento de onda de 600 nm, utilizando um leitor de microplacas Fluostar Omega eo MARS Software de Análise de Dados. Absorção a partir de culturas tratadas com antibiótico planctônicas (um antibiótico células planctônicas tratados) e absorção a partir do controlo negativo (um controlo negativo) deve ser corrigido por subtrairião da absorvância de fundo obtido a partir do LB poços contendo apenas (Um espaço em branco). A percentagem de inibição da viabilidade é subsequentemente calculada como (média ± antibióticas células planctônicas tratados / média Um controle negativo) x 100%. O PSMIC 90 é definida como a concentração do antibiótico causando inibição de 90% do crescimento bacteriano planctônico. Para determinar a viabilidade bacteriana após o tratamento com o antibiótico de escolha, 10 ul de 0,02% (v / v) resazurina (diluído em água destilada) é adicionado a cada poço e as placas são incubadas sob condições aeróbias durante 1 – 2 h, a 37 ° C, agitando a 150 rpm. As células viáveis ​​irá reduzir o corante azul resazurina para a forma resorufina rosa fluorescente. Após incubação com resazurina, monitorizar a fluorescência de cada poço utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, em um Omega Fluostar leitor de microplacas. Os dados devem ser analisados ​​como descrito serbaixo. 3. Determinação do biofilme Sessile Concentração Inibitória Mínima Célula (BSMIC) Culturas durante a noite de P. aeruginosa (neste caso, 15 isolados de P. aeruginosa são usados) deve ser diluído em LB para uma densidade óptica 600 de 0,05 (± 0,01), 1:100, em seguida, ainda mais diluída em ASM fresco (volume total de 1,8 ml). As culturas diluídas (1,8 ml) deve ser adicionado a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços tecido tratado. Três poços devem conter ASM apenas para utilização como um branco durante a análise de jusante (Secção 3.9). Fixar as placas de 24 poços com laboratório parafilme e incubar durante 3 dias sob condições aeróbicas ou microaerofílica a 37 ° C, enquanto agitação a 75 rpm. Microaerofilia devem ser obtidas usando compressas de gás CampyGen geração em grandes jarras de anaerobiose. Diluir o antibiótico de escolha, neste sulfato de tobramicina caso, para proporcionar uma gama de concentração apropriada em frescoASM. Neste exemplo, as concentrações finais variaram entre 512-1 ug / ml. Adicionar a cada concentração do antibiótico, em volumes de 200 ul, aos poços apropriados de as placas de 24 poços. Quatro repetições de cada concentração do antibiótico deverá ser executado. Biofilmes não expostas ao antibiótico de escolha foram utilizados como controlo negativo. Fixar as placas de 24 poços com laboratório parafilme e incubar em condições aeróbias ou microaerófilos para um 24 h mais a 37 ° C, agitando a 75 rpm. Após a incubação na presença do antibiótico de escolha, romper os biofilmes bacterianas usando 100 ul de 100 mg / ml de celulase (diluído em tampão de citrato 0,05 M [9,6 g / l Citrate.H 2 0 em água e pH para 4,6 com NaOH] ) e incubar as placas de 24 poços, em condições aeróbicas a 37 ° C, agitando a 150 rpm durante 1 h. Se necessário, biofilmes poderia ser ainda mais perturbada por pipetagem manual nesta fase. Para determinar as atividades metabólicasdas células bacterianas libertadas pelos biofilmes rompidas, 100 ul de 0,02% (v / v) resazurina (diluído em água destilada) deve ser adicionado a cada poço das placas de 24 poços e incubadas durante 1-2 horas a 37 ° C , agitando a 150 rpm. Após incubação com resazurina, medir a fluorescência de cada poço utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, em um leitor de microplacas Omega Fluostar eo MARS Software de Análise de Dados. Fluorescência a partir dos biofilmes tratadas com antibiótico (F tratadas com antibiótico biofilmes) e de fluorescência a partir dos controlos negativos (F controlo negativo) deve ser corrigido por subtracção da fluorescência de fundo obtidas a partir dos poços contendo apenas ASM (F em branco). A percentagem de inibição da viabilidade é subsequentemente calculada como (média de F antibióticas biofilmes tratados / média de controlo negativo F) x 100%. A 90 BSMIC é definida como a antibioconcentração tic causando inibição de 90% da atividade metabólica. 4. Os resultados representativos Formação de biofilmes ASM é possível em pequenas (2 ml) e os volumes de biofilmes são completamente formado dentro de 3 dias (Figura 1A). Isto pode ser demonstrado por pipetagem rigorosamente o biofilme, o qual deve ser difícil de romper. Os microcolônias são comparáveis ​​às cultivadas em volumes maiores 4 (Figura 1B). A Figura 2 mostra grandes diferenças entre as células cultivadas planktonically e em um biofilme como detectado por análise de imagem microscópica de electrões. Culturas de biofilme mostram claramente níveis consideráveis ​​de matriz extracelular que rodeia as células e estruturas individuais dentro do biofilme são difíceis de identificar. Vários estudos sugerem que o estilo de vida biofilme podem influenciar a susceptibilidade antimicrobiana 13, 14. Nosso ensaio em pequena escala ASM pode ser usado para Determine o BSMIC de antibióticos múltiplos para múltiplos isolados, ao mesmo tempo. O fluxo de trabalho do ensaio é mostrado na Figura 3. O efeito dos antibióticos sobre a viabilidade celular bacteriana pode ser medida utilizando o ensaio de resazurina. Antibióticos, neste caso tobramicina, pode ser adicionado ao biofilme estabelecida e incubou-se durante 24 h. Após este biofilme o é interrompido e resazurina é adicionado. Células metabolicamente activas podem reduzir o corante resazurina resultando numa alteração de cor de azul (resazurina) para rosa (resorufina) 15. Figura 4A mostra um ensaio de exemplo em que p aeruginosa foram incubados com diferentes concentrações de tobramicina antes perturbação do biofilme e adição de resazurina em uma placa de microtitulação. A cor não fluorescente azul indica células não-viáveis, enquanto que as células viáveis ​​reduzir o corante para a forma-de-rosa fluorescente, resorufina. A SMIC pode então ser calculada através da conversão de fluorescência em percentagemresidual viabilidade bacteriana. Figura 4B mostra a alteração em% de viabilidade com a concentração de tobramicina crescente. Viabilidade de 10% foi escolhido como um cut-off, a fim de calcular a 90 SMIC. Em condições aeróbicas, os tobramicina SMIC 90 valores são maiores para as células cultivadas como um biofilme do que os de culturas planctônicas. A Tabela 1 mostra a variação na PSMIC 90 e BSMIC 90 para todos os isolados testados. A Tabela 2 mostra que, sob condições aeróbicas, um aumento dramático na resistência a tobramicina (2 a> aumento de 32 vezes na SMIC) foi observada para a maioria dos isolados, quando cultivada em ASM (biofilme modo) em comparação com LB (modo planctônicas). Além disso, biofilmes crescidas sob condições microaerofílicas exibiram um aumento de SMIC entre 2 e> 128 vezes quando comparado com biofilmes crescidas sob condições aeróbias. Figura1. Formação de biofilme de P. aeruginosa em ASM P. aeruginosa cepa PAO1 forma touceiras macroscopicamente visíveis (microcolônias) quando cultivadas em ASM. A formação de biofilmes, em 30 ml culturas ASM (grande escala), após crescimento de 7 dias em vidro com tampa de rosca Duran frascos. B, a formação de biofilmes em 2 ml culturas ASM ( em pequena escala) após 3 dias de crescimento em placas de 24 poços de poliestireno. Figura 2. Micrografias TEM de biofilmes ASM A / C TEM Micrografia (x; 27.000) de PAO1 crescido planktonically e em ASM, respectivamente, B / D TEM micrografia (x57, 000) de plâncton PAO1grown e em ASM, respectivamente. Bactérias Planktonically cultivadas foram cultivadas durante a noite em caldo LB. Os biofilmes foram cultivados por 7 dias em 30 culturas ml ASM. Setas pretas referem-se às células dentro do biofilme e estrelas referem-se a espaços extracelulares. Barras de escala = 1iM. Figura 3. Fluxo de trabalho do ASM ensaio de susceptibilidade antimicrobiana de biofilme. Figura 4. A utilização de resazurina para a determinação da susceptibilidade aos antibióticos As células bacterianas foram incubadas com diferentes concentrações do antibiótico e da actividade metabólica restante foi determinado utilizando resazurina. A, A forma não fluorescente azul oxidada da resazurina indica células não-viáveis ​​e é reduzida por metabólica células activas para rosa fluorescente resorufina. B, a intensidade de fluorescência é convertida em percentagem de viabilidade bacteriana restante. Viabilidade de 10% foi escolhido como ponto de corte, a fim de calcular o MSMIC90. Clique aqui para ver larfigura ger. </span> Cepas PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1 Aeróbico 2 microaerofilia Aeróbico 2 microaerofilia PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemia Strain (LES) isolados LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES isolados 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabela 1. Suscetibilidade de P. aeruginosa à tobramicina. 1 Para a determinação de PSMICs e tobramicina BSMICs foi utilizado em duas diluições em série variando de 512-0,5 ug / ml (n = 8 para cada concentração) e 512-1 ug / ml (n = 4 para cada concentração), respectivamente;; PSMICs foram determinadas usando o padrão método de microdiluição 1. 2 condições microaerofílicas foram de 5% de O 2, 10% de CO 2, e 85% de N2. Tensão PSMIC 90/90 BSMIC mudança dobra 1 PSMIC aeróbico → Microaerofilia PSMIC BSMIC aeróbico → Microaerofilia BSMIC PSMIC aeróbico → BSMIC aeróbica PSMIC microaerofilia → Microaerofilia BSMIC PAO1 0 > 64 2 128 LES isola LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES isolados 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabela 2. Mudança de dobra PSMICs e BSMICs à tobramicina. 1 ND, não determinadas, valores em negrito indicam SMIC mudanças vezes> 10.