現在の診断抗菌薬感受性試験では、栄養豊富な、好気的条件下での分離株のプランクトンの成長に依存しています。ここでは、嚢胞性線維症の肺のより代表的な好気性および微好気性条件の両方の下で緑膿菌バイオフィルムの抗菌薬感受性を検討する別の人工痰媒体を採用しています。
Pの分離株に適用した場合にin vitroで抗菌薬感受性試験での関連性についての懸念が高まっている嚢胞性線維症(CF)患者から緑膿菌 。既存の方法は好気的及びplanktonically成長した単一または少数の単離に依存しています。所定のカットオフは、細菌が敏感であるか、または任意の抗生物質を1に耐性があるかどうかを定義するために使用されます。しかし、CF、P.の慢性肺感染症の中に緑膿菌の集団は、バイオフィルム内に存在し、環境が2大部分は好気性であるという証拠があります。診断テスト中に肺の中の細菌とそれらの間に条件の厳しい違いは、信頼性、さらにはこれらのテスト3の妥当性に疑問を呼びかけている。
人工痰媒体(ASM)は、アミノ酸、ムチンと遊離DNAを含む、CF患者の痰の成分を含有する培養培地である。P.緑膿菌<自己凝集バイオフィルムの構造と人口発散4,5,6の形成とCFの感染時にASMを模倣し成長に/ em>に成長。本研究の目的は、Pの抗菌薬感受性を検討するためのマイクロタイタープレートアッセイを開発することでした緑膿菌は、微好気性、好気条件の両方に適用可能であるASM、成長に基づいています。
ASMアッセイは、マイクロタイタープレート形式で開発されました。P.は、緑膿菌のバイオフィルムは、24時間ごとに異なる濃度で前の抗菌剤とのインキュベーションの3日間用に開発させた。バイオフィルムの破壊後、細胞生存率はレサズリンで染色することによって測定した。このアッセイは、15種類のPのトブラマイシンの付着細胞の最小発育阻止濃度(SMIC)を確認するために使用された好気性および微好気条件とSMICの値の下で緑膿菌分離株は、標準的な培養液成長で得られたものと比較した。があったしながら、それらのプランクトンと比較すると、ASMで育った菌株の増加MIC値のいくつかの証拠が、最大の違いは、ASM、システム内のトブラマイシンに向かって> 128倍に多くの抵抗の増加を示した微好気性条件でテスト細菌で見つかったとき好気的条件下で行われたアッセイと比較されます。
現在の感受性試験の方法と臨床転帰の間に関連性の欠如は、3つの現在の方法の妥当性を疑問視しています。 in vitroモデルのいくつかは、P.を研究するために以前に使用されている緑膿菌バイオフィルム7、8。 ASMバイオフィルムは、CFの肺9で観察されたもの似ているのに対し、しかしながら、これらの方法は、表面に接続されたバイオフィルムに依存しています。さらに、粘液の減少酸素濃度は、Pの動作を変更することが示されている緑膿菌 2および10抗生物質感受性に影響を与えます。したがって、ボイジャー微好気条件下でのG ASMは、抗菌薬感受性を勉強するのより現実的な環境を提供することがあります。
本研究では、P.を複製するためにASMに基づくin vitroモデルで小説を使用CFの肺4内の緑膿菌バイオフィルムの状態。モデルは、抗菌剤の小規模、高スループットのテストのために正常に変更された。
このアッセイの重要な手順は次のとおりです。
小規模ASMバイオフィルムモデルの明白なアプリケーションでは、バイオフィルムの抗菌薬感受性(BSMIC 90) のより現実的な判断である。嫌気性および微好気性のニッチは、CFの肺内に存在し、酸素が 成熟したバイオフィルム2、17の奥深くに制限されているという証拠がある。ここでは示している10月14日臨床P. ASMでの微好気性条件下ではトブラマイシンに対する感受性の低下- CF患者の喀痰から緑膿菌分離株は、かなり(≥128倍4)を示す。本研究の結果は、トブラマイシンなどの抗生物質が、P.に対してあまり有効であることが示唆された従来の感受性試験の方法によって示されるよりもCFの肺における緑膿菌感染症。これらの結果は、バイオ10の抗菌薬感受性に関する先行研究を反映しています。小スケールASMアッセイは、より良い治療の決定を通知するために意味のある抗生物質感受性データを生成するためのシンプルなハイスループットプラットフォームを提供します。アッセイは、全人口を代表できない場合があり、スクリーニングに拾われ、単一のコロニーで、従来の抗生物質感受性試験と同じ方法で制限されています。しかし、我々は非表面接続されたバイオフィルムの成長と微好気条件(II)を使用して適用されるアプローチは、(i)、明確な代替手段と、既存のメソッドへの潜在的な改善を表していると信じています。我々は、このアッセイはPを勉強するための適切なモデルであると結論緑膿菌のバイオフィルム集団。臨床現場での更なるテストは、抗生物質に対する感受性は、バイオフィルム成長P.に基づいてかどうかを確かめるだろう緑膿菌は、潜在的に改善し、微生物学的および臨床転帰を持つ別の抗生物質の選択肢につながる可能性があります。古典的なバイオフィルムモデルを用いた同様の調査がBSMIC値が生じることが示された抗生物質治療5,17別の勧告に。
抗感染薬の有効性のテストに加えて、ASMシステムは、P.の多様化を理解することを目的としたものと研究のための動物モデルへの格安、簡単かつ再現可能な代替手段を表し、 緑膿菌の集団。我々は、P.の自然集団における広範囲の不均一性を観察した緑膿菌は、CF患者の痰18、19から回収された。同様の表現型および遺伝子型の多様化は、それCF肺疾患の in vitroモデルで魅力的、ASM 4(と私たちの未発表データ)の成長中に観察することができます。 ASMモデルの相対的なシンプルさは、それが簡単に長期の適応実験はP.に抗生物質やその他のストレスの影響を監視することで、例えば、目的とした設計になります緑膿菌の人口発散。さらに、他の細菌性病原体がで成長させることができるASM。たとえば、2007年は、S.によるバイオフィルム形成を研究するためにASM Fouhy ら使用しているmaltophillia 20。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、動物実験、ウェルカム·トラスト(グラント089215)を置き換えるために排他的に健康研究のためのイギリス国立研究所、人道的な研究のための博士Hadwenトラスト、英国有数の医療研究慈善団体の資金調達をサポートする非動物の研究技術を認める。我々はまた、ノバルティスファーマ英国株式会社(無制限の教育助成金)を認める。
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |