Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em> Синегнойной палочки</em> В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

1. Подготовка искусственной среде мокроты (ASM) Добавить 4 г ДНК из спермы рыб в 250 мл стерильной воды очень медленно в течение нескольких часов. ДНК занимает несколько часов до полного растворения и может быть перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Добавить 5 г муцина из свиного желудка (тип II) медленно в 250 мл стерильной воды до муцина полностью не растворится. Решение может быть перемешивают в течение ночи при 4 ° C. Растворить 0,25 г каждая существенные и несущественные L-аминокислот, за исключением L-тирозина и L-цистеин, в 100 мл стерильной воды. Растворить 0,25 г L-цистеина в 25 мл 0,5 М гидроксида калия (М т 56,11 г / моль) и 0,25 г L-тирозин в 25 мл стерильной воды. Растворите 5,9 мг диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), 5 г NaCl и 2,2 г хлорида калия в 100 мл стерильной воды. Объединить ДНК, муцин, L-аминокислот, DTPA, NaCl и KCl в 1 литровую бутылку. Добавьте 5 мл яичного желтка электроннойmulsion и заполнения около 850 мл стерильной воды. Отрегулируйте рН до 6,9 с 1 M трис (рН 8,5, M т 121,14) и довести объем до 1 литра стерильной водой. Стерилизовать АНМ по фильтрации с использованием Vacuubrand ME 2 диафрагмы вакуумного насоса и фильтра Millipore Steritop единиц с порами и шеи размером 0,22 мкм и 45 мм соответственно. Каждый блок Steritop фильтр может использоваться повторно сразу в три раза, однако, фильтры нужно промывать два раза стерильной водой перед повторным использованием. Процесс фильтрации происходит медленно и могут быть выполнены в течение 2 дней. Другие версии ASM были разработаны, в которых используется добавление антибиотиков вместо фильтрации 11 Однако, из-за возможных взаимодействий с другими препаратами, мы не рекомендуем этот метод для конкретного приложения. Без фильтра и фильтруется АНМ должны храниться при температуре 4 ° С в темноте. Использование свежей АНМ рекомендуется однако, это может быть в этих условиях в течение не более одного месяца. </lя> 2. Определение планктонных сидячие Сотовые минимальный метаболический ингибирующая концентрация (PSMIC) Для определения минимальной концентрации метаболических тормозные (PSMIC) значения за 15 planktonically выросли П. палочки изолятов, микроразведений метода должно быть выполнено, как описано в руководстве Британского общества по антимикробной химиотерапии BSAC 12. Антибиотик выбора, в этом случае сульфатов тобрамицин, серийно разводили в Лурия-Бертани (LB) среды в 96-и иммунологических планшет, чтобы обеспечить надлежащий диапазон концентрации антибиотиков. Развести ночь культур P. палочки в LB к OD 600 0,05 (± 0,01) и добавить 100 мкл в лунки 96-луночного иммунологических планшет, содержащий 100 мкл серийно разбавляют антибиотик. В этом случае конечной концентрации тобрамицина сульфата составляет от 512 – 0,5 мкг / мл. Восемь серии из Антибiotic концентрация должна быть выполнена. Отрицательные скважин управления для каждого изолировать должны быть созданы, в котором не антибиотик добавляется. Кроме того, восемь скважин должен содержать только LB для использования в качестве пустой во время ниже по течению анализа (раздел 2.6). Инкубируйте 96-луночного микропланшет в течение 1 – 2 дня при температуре 37 ° C без встряхивания в аэробных или микроаэрофильных (5% O 2, 10% CO 2, и 85% N 2) условиям. Микроаэрофильных условиях получены с использованием CampyGen газовой генерации пакетов в больших анаэробных банки. После инкубации бактерий определяется путем измерения оптической плотности бактериальной культуры в каждой лунке при длине волны 600 нм с использованием Fluostar Омега микропланшетов читателя и анализа MARS данных программного обеспечения. Поглощение из обработанных антибиотиками планктонных культур (антибиотик обработанные клетки планктона) и поглощения от негативного контроля (отрицательный контроль) должны быть исправлены путем вычитанияионов фоне абсорбции, полученной из скважин содержащих LB только (пустой). Процент ингибирования жизнеспособность в дальнейшем рассчитывается как (в среднем антибиотик обработанные клетки планктонных / означает отрицательный контроль) х 100%. PSMIC 90 определяется как концентрации антибиотика вызывает 90% ингибирование планктонных бактерий. Для определения жизнеспособности бактериальных после лечения антибиотиком выбора, 10 мкл 0,02% (объем / объем) resazurin (разводят в дистиллированной воде) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубируют в аэробных условиях в течение 1 – 2 ч при 37 ° C, при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Жизнеспособных клеток позволит снизить синего красителя resazurin в розовый флуоресцентный форме resorufin. После инкубации с resazurin, следить за флуоресценцию каждой скважине при возбуждении длиной волны 540 нм и длиной волны излучения 590 нм в Fluostar Омега микропланшетов читателя. Эти данные должны быть проанализированы, как описано бытьнизкая. 3. Определение концентрации биопленки сидячие минимальных ингибирующих Cell (BSMIC) Ночь культуры P. палочки (в данном случае, 15 изолятов P. палочки используются) следует развести в LB к OD 600 0,05 (± 0,01), то дальнейшее разбавленной 1:100 в свежем ASM (общий объем 1,8 мл). Разведенный культур (1,8 мл) следует добавить в каждую лунку 24-луночного культуры тканей лечение пластины. Три скважины должно содержать АНМ только для использования в качестве пустой во время ниже по течению анализа (раздел 3.9). Безопасность 24-луночных планшетах с лабораторными парафильмом и инкубировать в течение 3 дней в аэробных или микроаэрофильных условиях при 37 ° C, при встряхивании при 75 оборотах в минуту. Микроаэрофильных условия должны быть получены с помощью CampyGen газовой генерации пакетов в больших анаэробных банки. Развести антибиотик выбора в этом случае сульфатов тобрамицин, чтобы обеспечить соответствующий диапазон концентрации в преснойASM. В этом случае конечной концентрации колебались от 512 – 1 мкг / мл. Добавить каждой концентрации антибиотика, в объеме 200 мкл, в лунки 24-луночных планшетах. Четыре серии из концентрации антибиотика должны быть выполнены. Биопленки не подвергается антибиотик выбора были использованы в качестве отрицательного контроля. Безопасность 24-луночных планшетах с лабораторными парафильмом и инкубировать в аэробных или микроаэрофильных условия для еще 24 ч при температуре 37 ° C, при встряхивании при 75 оборотах в минуту. После инкубации в присутствии антибиотика выбора, нарушить бактериальную биопленку с использованием 100 мкл 100 мг / мл целлюлозы (разбавленный в 0,05 М буфера цитрата [9,6 г / л Citrate.H 2 0 в воде и рН до 4,6 с NaOH] ) и инкубировать 24-луночных планшетах в аэробных условиях при 37 ° C, при встряхивании на 150 оборотов в минуту в течение 1 часа. При необходимости, биопленки могут быть дополнительно нарушается ручной пипетирования на данном этапе. Для определения метаболической активностибактериальных клеток освобождается от нарушена биопленки, 100 мкл 0,02% (объем / объем) resazurin (разводят в дистиллированной воде) должны быть добавлены в каждую лунку 24-луночных планшетах и ​​инкубировали в течение 1 – 2 ч при 37 ° C , при встряхивании при 150 оборотах в минуту. После инкубации с resazurin, измерять флуоресценцию каждой лунки использованием длины волны возбуждения 540 нм и длиной волны излучения 590 нм в Fluostar Омега микропланшетов читателя и анализа MARS данных программного обеспечения. Флуоресценции от обработанный антибиотиком биопленки (F, обработанный антибиотиком, биопленки) и флуоресценции от негативного контроля (F отрицательного контроля) должна быть исправлена ​​путем вычитания фоновой флуоресценции получены из скважин содержащих только ASM (F пустым). Процент ингибирования жизнеспособность в дальнейшем рассчитывается как (в среднем лечение антибиотиками F биопленки / F означает отрицательный контроль) х 100%. BSMIC 90 определяется как antibioтик концентрация, вызывающая 90% подавление метаболической активности. 4. Представитель Результаты ASM образование биопленки можно в небольших (2 мл) объемы и биопленки полностью сформирован в течение 3 дней (рис. 1А). Это может быть продемонстрировано с помощью пипетки строго биопленки, которые должны быть трудно нарушить. Микроколоний сопоставимы с выращивается в больших объемах 4 (рис. 1б). На рисунке 2 показаны основные различия между клеток, выращенных planktonically и в биопленки, которая была определена на электронно-микроскопического анализа изображений. Биопленки культур ясно показывают значительное уровня внеклеточного матрикса окружающие клетки и отдельных структур в биопленки трудно определить. Некоторые исследования показывают, что биопленки образа жизни могут повлиять на антимикробную чувствительность 13, 14. Наш небольшой масштаб АНМ анализ может быть использован для Определяетrmine BSMIC нескольких антибиотиков для нескольких штаммов одновременно. Рабочий процесс анализа показано на рисунке 3. Влияние антибиотиков на бактериальные жизнеспособность клеток может быть измерена с помощью анализа resazurin. Антибиотики в данном случае тобрамицин, могут быть добавлены к установленному биопленки и инкубировали в течение 24 часов. После этого биопленки нарушается и resazurin добавляется. Метаболическую активность клеток может уменьшить resazurin красителя в результате изменения цвета от синего (resazurin) до розового (resorufin) 15. Рисунок 4а показан пример анализа, в котором П. палочки инкубировали с различными концентрациями тобрамицин до нарушения биопленки и добавления resazurin в планшета. Синий без флуоресцентного цвета указывает нежизнеспособных клеток, в то время как жизнеспособных клеток уменьшить красителя розового флуоресцентного форме, resorufin. МРОТ может быть вычислена путем преобразования флуоресценции в процентахОстальные бактериальной устойчивости. рисунок 4B показывает изменение в% жизнеспособность при увеличении концентрации тобрамицин. 10% жизнеспособность была выбрана в качестве отсечения для расчета МРОТ 90. В аэробных условиях, тобрамицин МРОТ 90 значений выше для клеток, выращенных в биопленки, чем планктона культур. В таблице 1 показаны изменения в PSMIC 90 и BSMIC 90 для всех изолятов испытания. Таблица 2 показывает, что в аэробных условиях, резкое увеличение сопротивления тобрамицин (2> 32 кратное увеличение МРОТ) наблюдается для большинства изолятов при выращивании в ASM (биопленки режим) по сравнению с LB (планктонные режим). Кроме того, биопленок, выращенных в условиях микроаэрофильных выставлены увеличился МРОТ от 2 до> 128 раз по сравнению с биопленок, выращенных в аэробных условиях. Рисунок1. Биопленки из палочки в П. П. АНМ палочки штамма PAO1 является макроскопически видимых скоплений (микроколонии) при выращивании в ASM., образование биопленки в 30 мл АНМ культуры (крупный), после 7 дней роста винтовой крышкой стеклянной колбы Duran. B, формирование биопленок в 2 мл АНМ культур ( мелкие) после 3 дней роста в 24-луночных полистирола. Рисунок 2. ПЭМ микрофотографии АНМ биопленки А / С ТЕМ микроскопа (х, 27 000) из PAO1 выросли planktonically и АНМ соответственно, B / D ПЭМ микрофотографии (x57, 000) PAO1grown планктонных и АНМ соответственно. Planktonically выращивают бактерии выращивали в течение ночи в LB бульоне. Биопленки культивировали в течение 7 дней в 30 мл АНМ культур. Черные стрелки ссылаться на ячейки в биопленки и звезды относятся к внеклеточного пространства. Масштаб баров = 1мкм. Рисунок 3. Workflow АНМ биопленки антимикробной чувствительности анализа. Рисунок 4. Использование resazurin для определения антибиотиков восприимчивости бактериальные клетки инкубировали с различными концентрациями антибиотика, а остальные метаболической активности определяли с помощью resazurin., Синий, не люминесцентные окисленной форме resazurin указывает нежизнеспособных клеток и уменьшается метаболический активные клетки розового флуоресцентного resorufin. B, интенсивность флуоресценции преобразуется в процентах оставшихся бактериальной устойчивости. 10% жизнеспособность была выбрана в качестве отсечения для расчета MSMIC90. Щелкните здесь для просмотра LARгер фигуры. </span> Деформации PSMIC 90 (мкг / мл) 1 BSMIC 90 (мкг / мл) 1 Аэробный Микроаэрофильных 2 Аэробный Микроаэрофильных 2 PAO1 4 4 8 > 512 Ливерпуль эпидемии штамма (LES) изолирует LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-ЛЕ изолятов 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ TD> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Таблица 1. Восприимчивость к П. палочки тобрамицин. 1 Для определения PSMICs и BSMICs тобрамицин использовался в 2 раза серийных разведений от 512 – 0,5 мкг / мл (n = 8 для каждой концентрации) и 512 – 1 мкг / мл (п = 4 для каждого концентрации), соответственно;; PSMICs определяли с помощью стандартных микроразведений метода 1. 2 микроаэрофильных условиях на 5% O 2, 10% CO 2, и 85% N 2. Напрягать PSMIC 90 / BSMIC 90 раз изменения 1 PSMIC аэробных → PSMIC микроаэрофильных BSMIC аэробных → BSMIC микроаэрофильных PSMIC аэробных → BSMIC аэробных PSMIC микроаэрофильных → BSMIC микроаэрофильных PAO1 0 > 64 2 128 LES изолирует LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-ЛЕ изолятов 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </TD> 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Таблица 2. Fold изменения PSMICs и BSMICs в тобрамицин. 1 Н.Д., не определено, значения жирным шрифтом указывают МРОТ раза изменений> 10.