JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em> Pseudomonas aeruginosa</em> בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

Published: June 05, 2012
doi:
10.3791/3857
, , , , ,
1Institute of Infection and Global Health,University of Liverpool , 2NIHR Biomedical Research Centre in Microbial Disease,University of Liverpool

Summary

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

Abstract

גוברת הדאגה לגבי הרלוונטיות של במבחנה הבדיקות הרגישות מיקרוביאלית כשמדובר מבודד של פ ' aeruginosa מ סיסטיק פיברוזיס (CF) חולים. שיטות קיימות להסתמך על יחיד או מבודד כמה גדל aerobically ו planktonically. מראש לחתוך-offs רגילים להגדיר האם החיידקים רגישים או עמידים בפני אנטיביוטיקה נתון 1. עם זאת, במהלך דלקות ריאה כרוניות ב CF, פ אוכלוסיות aeruginosa קיימים biofilms ויש ראיות לכך הסביבה היא microaerophilic בעיקר 2. ההבדל שטרק בתנאים בין חיידקים בריאה לבין אלה במהלך בדיקות אבחון בספק את הרלוונטיות אמינות ואפילו של בדיקות אלה 3.

בינוני כיח מלאכותית (ASM) היא בינונית התרבות המכיל את מרכיבי כיח החולה CF, כולל חומצות אמינו, mucin ו-DNA חופשי. פ aeruginosa </ Em> גידול בצמיחה מחקה ASM במהלך זיהומים CF, עם הקמתה של עצמי צבירה מבנים biofilm ו סטייה האוכלוסייה 4,5,6. מטרת מחקר זה הייתה לפתח assay microtitre-הצלחת ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של פ ' aeruginosa מבוסס על הצמיחה ASM, שהוא החלים על שני התנאים microaerophilic ו אירובית.

Assay ASM פותחה בפורמט צלחת microtitre. פ biofilms aeruginosa הורשו לפתח במשך 3 ימים לפני הדגירה עם סוכני מיקרוביאלית בריכוזים שונים עבור 24 שעות. לאחר הפרעה biofilm, כדאיות התא נמדדה על ידי מכתימה עם resazurin. Assay זה נעשה שימוש כדי לקבוע את התא המינימלי נייחים ריכוז מעכבות (SMIC) של tobramycin עבור 15 פ 'שונה מבודד aeruginosa בתנאים אירוביים ו microaerophilic וערכים SMIC הושוו לאלו שהושגו עם צמיחה מרק סטנדרטי. בעוד שישראיות עבור ערכים מיקרופון מוגבר מבודד שגודלו ASM בהשוואה לעמיתיהם planktonic שלהם, ההבדלים הגדולים ביותר נמצאו עם חיידקים שנבדקו בתנאים microaerophilic, אשר הראו עמידות מוגברת יותר של עד פי 128>, לקראת tobramycin במערכת ASM כאשר לעומת מבחני שבוצעו בתנאים אירוביים.

היעדר קשר בין בדיקות שוטפות שיטות הרגישות ואת התוצאה הקלינית הטיל ספק בתוקפו של השיטות הקיימות 3. כמה במודלים חוץ גופית שימשו בעבר כדי ללמוד פ ' aeruginosa biofilms 7, 8. עם זאת, שיטות אלו מבוססות על biofilms משטח המצורפת, בעוד biofilms ASM דומות לאלו שנצפו ריאות CF 9. בנוסף, ריכוז חמצן מופחת ריר הוכח לשנות את אופן הפעולה של פ ' aeruginosa 2 ולהשפיע על רגישות לאנטיביוטיקה 10. לכן usinגרם ASM בתנאים microaerophilic יכול לספק סביבה מציאותית יותר שבו ללמוד הרגישות מיקרוביאלית.

Protocol

1. הכנת בינוני כיח מלאכותית (ASM) הוסף 4 גרם של ה-DNA הזרע דגים 250 מ"ל מים סטריליים לאט לאט על פני תקופה של מספר שעות. ה-DNA לוקח כמה שעות כדי להמיס לחלוטין וניתן עוררה הלילה בטמפרטורת החדר. הוסף 5 גרם mucin מ חזירי הבטן (סוג II) לאט 250 מ"ל מים סטריליים עד mucin נמס לגמרי. הפתרון יכול להיות עורר לילה ב 4 ° C. ממיסים 0.25 גרם של חומצה כל L-האמינו החיוניות והלא חיוניות, למעט טירוזין-L ו-L-ציסטאין, במים 100 מ"ל סטרילי. ממיסים 0.25 גרם של ציסטאין-L ב 25 מ"ל של אשלגן הידרוקסידי M 0.5 (M r 56.11 g / mol) ו – 0.25 גרם טירוזין L-במים 25 מ"ל סטרילי. ממיסים 5.9 מ"ג חומצה diethylenetriaminepentaacetic (DTPA), 5 גרם NaCl ו -2.2 גרם של KCl ב 100 מ"ל של מים סטריליים. שלב ה-DNA, mucin, L-חומצות אמינו, DTPA, NaCl ו KCl בבקבוק 1 ליטר. הוסף 5 מ"ל של חלמון ביצה דוארmulsion ומילוי כדי כ 850 מ"ל עם מים סטריליים. התאם את ה-pH 6.9 עם 1 M Tris (pH 8.5, M R 121.14) ולהביא את נפח 1 ליטר עם מים סטריליים. לעקר ASM ידי סינון באמצעות Vacuubrand ME 2 משאבת ואקום הסרעפת Millipore יחידות Steritop מסנן עם הנקבוביות וגודל הצוואר של 0.22 מיקרון ו -45 מ"מ, בהתאמה. כל יחידה מסנן Steritop ניתן שימוש חוזר מיידי עד שלוש פעמים, אך המסננים צריך לשטוף פעמיים לפני שימוש חוזר עם מים סטריליים. תהליך הסינון הוא איטי והוא יכול להתבצע על 2 ימים. גירסאות אחרות של ASM פותחו להשתמש תוספת של אנטיביוטיקה במקום 11 עם זאת סינון, עקב תרופתיות האפשריות, לא מומלץ שיטה ליישום מסוים זה. ללא פילטר סינון ASM צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחושך. שימוש ASM טרי מומלץ עם זאת, זה יכול להיות כל הזמן תחת תנאים אלו לתקופה מקסימלית של חודש אחד. </lאני> 2. קביעת תא נייחים Planktonic ריכוז מינימום מעכבות מטבולית (PSMIC) כדי לקבוע את הריכוז המינימלי מעכבות מטבולית (PSMIC) ערכים 15 פ 'גדלה planktonically מבודד aeruginosa, שיטת microdilution יש לבצע, כפי שמתואר בהנחיות של החברה הבריטית Antimicrobial כימותרפיה BSAC 12. אנטיביוטיקה של בחירה, של סולפט זה tobramycin במקרה, הוא מדולל סדרתי בצלחת 96-microtitre גם כדי לספק מגוון מתאים של ריכוזי אנטיביוטיקה לוריא-Bertani (LB) בינוני. לדלל תרבויות לילה של פ ' aeruginosa ב LB כדי OD של 600 0.05 (± 0.01) ולהוסיף 100 כרכים μl על בארות של צלחת 96-גם microtitre המכיל 100 μl של אנטיביוטיקה בדילול סדרתי. במקרה זה, הריכוזים האחרונים של tobramycin סולפט נע בין 512-0.5 מיקרוגרם / מ"ל. שמונה משכפל של כל antibריכוז iotic יש לבצע. בארות שליטה שליליות על כל לבודד יש להגדיר, שבו לא אנטיביוטי נוסף. כמו כן, שמונה בארות צריך להכיל רק LB לשימוש ריק במהלך ניתוח במורד הזרם (סעיף 2.6). דגירה לוחות 96-microtitre גם עבור 1 – 2 ימים ב 37 מעלות בלי ללחוץ בתנאים אירוביים או microaerophilic (5% מ 2, 10% CO 2, ו 85% N 2). תנאי Microaerophilic מתקבלים באמצעות הדור CampyGen גז חבילות בצנצנות גדולות אנאירוביים. לאחר הדגירה, התפתחות חיידקים נקבע על ידי מדידת ספיגת התרבות החיידקים גם בכל באורך גל של 600 ננומטר באמצעות אומגה Fluostar microplate הקורא תוכנה נתונים MARS ניתוח. הקליטה של אנטיביוטיקה שטופלו תרבויות planktonic (מספר תאים אנטיביוטיות planktonic שטופלו) וקליטה של הפקדים (פקד שליליות שלילי), יש לתקן על ידי חיסוריון של ספיגת הרקע המתקבל LB בארות המכיל בלבד (ריק). עיכוב אחוז הכדאיות מחושב לאחר מכן בתור (כלומר כמה תאים אנטיביוטיות planktonic שטופלו / התכוונתי שליטה שלילי) x 100%. PSMIC 90 מוגדר ריכוז האנטיביוטיקה גורמת עיכוב 90% של צמיחה planktonic חיידקי. כדי לקבוע את הכדאיות חיידקי לאחר טיפול אנטיביוטי של בחירה, 10 μl של 0.02% (V / V) resazurin (מדולל במים מזוקקים) מתווסף כל טוב והצלחות מודגרת בתנאים אירוביים במשך 1-2 שעות על 37 ° C, בעוד רועד בסל"ד 150. תאים קיימא תצמצם את הצבע הכחול resazurin לטופס resorufin ורוד ניאון. לאחר הדגרה עם resazurin, לפקח על הקרינה של כל אחת גם באמצעות עירור באורך גל של 540 ננומטר אורך גל הפליטה של ​​590 ננומטר אומגה Fluostar microplate הקורא. הנתונים יש לנתח כמתואר להיותנמוך. 3. קביעת biofilm מינימום נייחים ריכוז Cell מעכבות (BSMIC) תרבויות לילה של פ ' aeruginosa (במקרה זה, 15 מבודד של aeruginosa פ משמשים) צריך להיות מדולל LB כדי OD של 600 0.05 (± 0.01), 1:100 אז בדילול מלא נוספת ASM טרי (סה"כ 1.8 מ"ל נפח). התרבויות למניה (1.8 מ"ל) יש להוסיף גם כל צלחת 24 גם רקמת התרבות טיפול. שלוש בארות צריך להכיל ASM רק לשימוש ריק במהלך ניתוח במורד הזרם (סעיף 3.9). תאבטחו את 24 גם צלחות עם המעבדה parafilm ו דגירה במשך 3 ימים בתנאים אירוביים או microaerophilic על 37 מעלות צלזיוס, בעוד רועד בסל"ד 75. תנאי Microaerophilic יש לקבל באמצעות CampyGen דור גז חבילות בצנצנות גדולות אנאירוביים. לדלל את האנטיביוטיקה של בחירה, של סולפט tobramycin זה המקרה, על מנת לספק טווח הריכוז המתאים טריASM. במקרה כזה, ריכוז האחרונים נע בין 512-1 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף כל ריכוז של אנטיביוטיקה, בנפחים של μl 200, אל בארות המתאימה של 24 גם הצלחות. ארבעה משכפל ריכוז כל אנטיביוטיקה יש לבצע. Biofilms שלא נחשפו לאנטיביוטיקה הבחירה שימשו כביקורת שלילית. תאבטחו את 24 גם צלחות עם המעבדה parafilm ו דגירה בתנאים אירוביים או microaerophilic עבור שעות נוספות 24 ב 37 מעלות צלזיוס, בעוד רועד בסל"ד 75. לאחר הדגרה בנוכחות האנטיביוטיקה של בחירה, לשבש את biofilms חיידקי באמצעות 100 μl של 100 מ"ג / מ"ל cellulase (בדילול במאגר M 0.05 ציטראט [9.6 גר '/ ליטר Citrate.H 2 0 במים pH ל 4.6 עם NaOH] ) ו דגירה של 24 צלחות גם בתנאים אירוביים על 37 מעלות צלזיוס, בעוד רועד בסל"ד 150 עבור H 1. במידת הצורך, biofilms יכול להשתבש עוד יותר בשלב זה על ידי pipetting ידנית. כדי לקבוע את פעילות חילוף החומריםשל תאים חיידקיים שפורסמו מתוך biofilms משתבש, 100 μl של 0.02% (V / V) resazurin (מדולל במים מזוקקים) יש להוסיף גם כל אחד 24 גם הצלחות מודגרת למשך 1-2 שעות ב 37 ° C בעוד רועד בסל"ד 150. לאחר הדגרה עם resazurin, למדוד את הקרינה של כל אחת גם באמצעות עירור באורך גל של 540 ננומטר אורך גל הפליטה של ​​590 ננומטר אומגה Fluostar microplate הקורא תוכנה נתונים MARS ניתוח. הקרינה מן שטופלו באנטיביוטיקה biofilms (F שטופלו באנטיביוטיקה biofilms) ואת הקרינה מן הפקדים שליליים (F בקרה שלילית), יש לתקן על ידי חיסור של הקרינה רקע להשיג את בארות המכילים ASM בלבד (F ריק). עיכוב אחוז הכדאיות מחושב לאחר מכן בתור (ממוצע של פריץ biofilms מטופלים אנטיביוטיות / מתכוון השליטה F שלילי) x 100%. 90 BSMIC מוגדר antibioריכוז טיק גרימת עיכוב 90% מכלל הפעילות המטבולית. 4. נציג תוצאות היווצרות biofilm ASM אפשרי (2 מ"ל) בנפחים קטנים ואת biofilms נוצרות באופן מלא תוך 3 ימים (איור 1 א). זו ניתן להדגים על ידי בקפדנות pipetting biofilm, שאמור להיות קשה לשבש. Microcolonies הם דומים לאלה גדל בכמויות גדולות 4 (1 ב 'איור). איור 2 מראה הבדלים משמעותיים בין תאים שגודלו planktonically וב biofilm כפי זוהה על ידי ניתוח תמונת מיקרוסקופית אלקטרונים. תרבויות biofilm בבירור רמות גדולות של תאי מטריקס סביב התאים ומבנים בודדים בתוך biofilm קשה לזהות. מספר מחקרים מראים כי אורח חיים biofilm יכולים להשפיע על הרגישות מיקרוביאלית 13, 14. Assay ASM הקטן שלנו בקנה מידה ניתן להשתמש בהם כדי determine BSMIC באנטיביוטיקה מרובים עבור מבודד מרובים בו זמנית. זרימת העבודה של assay מוצגת באיור 3. השפעה של אנטיביוטיקה על הכדאיות תא החיידק ניתן למדוד באמצעות assay resazurin. אנטיביוטיקה, ב tobramycin במקרה זה, ניתן להוסיף biofilm הקים מודגרת למשך 24 שעות. לאחר biofilm זו מופרת resazurin הוא הוסיף. תאים פעילים מבחינה מטבולית יכול להפחית את צבע resazurin וכתוצאה מכך שינוי צבע כחול (resazurin) לוורוד (resorufin) 15. איור 4 א מראה assay למשל, שבו פ aeruginosa הודגר עם ריכוזים שונים של tobramycin לפני שיבוש biofilm והוספת resazurin בצלחת microtitre. הצבע הכחול מצביע על אי – ניאון לא קיימא תאים, בעוד תאים קיימא להפחית את צבע לטופס ניאון ורוד, resorufin. SMIC יכול להיות מחושב על ידי המרת הקרינה לתוך אחוזנותרו הכדאיות חיידקי. איור 4B מראה את השינוי הכדאיות% בריכוז tobramycin גוברת. הכדאיות 10% נבחר ניתוק כדי לחשב את 90 SMIC. בתנאים אירוביים, את SMIC tobramycin 90 ערכים גבוהים יותר של תאים שגודלו כ biofilm מאלה של תרבויות planktonic. טבלה 1 מראה וריאציה PSMIC 90 ו 90 BSMIC לכל מבודד שנבדקו. לוח 2 מראה כי בתנאים אירוביים, עלייה דרמטית התנגדות tobramycin (2 לגידול 32> פי SMIC) נצפתה ברוב מבודד כאשר גדל ASM (biofilm מצב) בהשוואה ל LB (מצב planktonic). בנוסף, biofilms הגדלים בתנאים microaerophilic הציג SMIC מוגברת של בין 2 ל> פי 128 בהשוואה biofilms שגודלו בתנאים אירוביים. תרשים1. Biofilm היווצרות aeruginosa פ 'פ' ב ASM זן aeruginosa PAO1 יוצרת גושים הנראים macroscopically (microcolonies) כאשר גדל ב ASM., biofilm היווצרות ב -30 תרבויות ASM מ"ל (בקנה מידה גדול) לאחר צמיחה של 7 ימים בורג מכסה זכוכית דוראן צלוחיות. ב ', היווצרות biofilm ב 2 תרבויות מ"ל ASM ( בקנה מידה קטן), לאחר גידול 3 ימים ב 24 גם לוחות קלקר. איור 2. Micrographs TEM של biofilms ASM / C TEM מיקרוסקופ (x, 27000) של PAO1 גדל planktonically וב ASM, בהתאמה, B / D TEM מיקרוסקופ (x57, 000) של planktonic PAO1grown וב ASM, בהתאמה. חיידקים הגדלים Planktonically עובדו לילה במרק LB. Biofilms עובדו במשך 7 ימים ב -30 תרבויות מ"ל ASM. חיצים שחורים להתייחס לתאים בתוך biofilm וכוכבים מתייחסים מקומות תאיים. בקנה מידה ברים = 1מיקרומטר. איור 3. זרימת עבודה של assay biofilm ASM הרגישות מיקרוביאלית. באיור 4. השימוש resazurin להגדרה של רגישויות אנטיביוטיות תאים חיידקיים היו מודגרות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה ואת הפעילות המטבולית הנותרים נקבע באמצעות resazurin., טופס כחול ללא ניאון חמצון של resazurin מציין שאינו קיימא תאים הוא מופחת על ידי חילוף חומרים תאים פעילים ורוד ניאון resorufin. B, עוצמת הקרינה הופך אחוז הכדאיות חיידקי הנותרים. הכדאיות 10% נבחר חתוכים כדי לחשב את MSMIC90. לחץ כאן כדי להציג LARגר הדמות. </span> זנים PSMIC 90 (מיקרוגרם / מ"ל) 1 BSMIC 90 (מיקרוגרם / מ"ל) 1 אירובי Microaerophilic 2 אירובי Microaerophilic 2 PAO1 4 4 8 > 512 ליברפול מגפת הזנים (LES) מבודד LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-les מבודד 49461 16 32 16 > 512 59032 0.5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 טבלה 1. הרגישות של aeruginosa פ 'tobramycin. 1 לקביעת PSMICs ו BSMICs tobramycin שימש פי 2 דילולים סדרתי החל 512-0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(n = 8 ריכוז כל אחת) ו – 512-1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(n = 4 עבור כל אחד ריכוז), בהתאמה; PSMICs נקבעו באמצעות תקן microdilution שיטה 1. 2 תנאים Microaerophilic היו 5% מ 2, 10% CO 2, ו 85% N 2. להתאמץ PSMIC 90/90 BSMIC שינוי קיפול 1 PSMIC אירובית → PSMIC microaerophilic BSMIC אירובית → BSMIC microaerophilic PSMIC אירובית → BSMIC אירובית PSMIC microaerophilic → BSMIC microaerophilic PAO1 0 > 64 2 128 LES מבודד LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0.25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-les מבודד 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </TD> 2 > 16 27 2 > 128 0.5 > 32 45 2 > 128 0.25 > 16 טבלה 2. שינוי של פולד PSMICs ו BSMICs ל tobramycin. 1 ND, לא נקבע, הערכים מודגש מצביעים על שינויים לקפל SMIC> 10.

Discussion

במחקר זה השתמשנו במודל חוץ גופית הרומן מבוסס על ASM לשכפל פ biofilm aeruginosa התנאים בתוך 4 ריאות CF. מודל שונה בהצלחה בדיקות בקנה מידה קטן תפוקה גבוהה, של סוכני מיקרוביאלית.

השלבים הקריטיים של assay זה הם:

  1. הכנה עקבית של התקשורת ASM ועקרות שמירה. אנחנו הקדישו שעות רבות כדי לייעל את האופן שבו כל רכיב נוסף כדי להשיג תוצאות לשחזור בכל פעם. סינון של ASM איטי אבל עדיף מעוקר, אשר עלול לגרום נזק מרכיב mucin. אנחנו לא ממליצים על תוספת של אנטיביוטיקה, כפי שהוצע על ידי אחרים 11, כיוון שהדבר עלול להטיל לחצים בררניים ניכרים, מוטציות מניעות, לגרום תמוגה prophage 16 ו לשנות באופן משמעותי את הביטוי של גנים חיידקים רבים.
  2. Assay צריך להיות מותאם על פי נפח Oו ASM בשימוש. מהירויות רועדות מוגדלים עבור אמצעי אחסון קטנות יותר biofilm מחזור חיים קצר יותר הוא ציין.

היישום הברור של דגם בקנה מידה קטן biofilm ASM היא קביעה מציאותית יותר של רגישויות biofilm מיקרוביאלית (BSMIC 90). נישות אנאירוביים ו microaerophilic נמצאים ריאות CF ויש ראיות לכך חמצן מוגבל עמוק בתוך biofilms בוגרת 2, 17. כאן אנו מראים כי 10/14 פ קליני מבודד aeruginosa מ CF המטופלת ספוטה התערוכה רב (4 – ≥ 128 לקפל) ירידה רגישות tobramycin בתנאים microaerophilic ב ASM. תוצאות המחקר הזה מצביעים על כך אנטיביוטיקה, כגון tobramycin, עשוי להיות פחות יעיל נגד פ aeruginosa דלקות ריאות CF מכפי שצוין על ידי שיטות בדיקה המקובלות הרגישות. תוצאות אלו משקפות מחקרים קודמים על הרגישות מיקרוביאלית של biofilms 10. קטןמבחני ASM בקנה מידה ובכך לספק פלטפורמה פשוטה תפוקה גבוהה ליצירת משמעות הנתונים הרגישות אנטיביוטיות כדי ליידע טוב יותר החלטות טיפוליות. Assay מוגבל באותו אופן כמו בדיקה רגילה רגישות אנטיביוטיקה כי מושבות בודדות נקטפים להקרנה כי לא יכול להיות מייצג של האוכלוסייה כולה. עם זאת, אנו מאמינים כי הגישה (א) שימוש לא לפני השטח צמיחה biofilm המצורף (ב) החל על תנאים microaerophilic, מהווה חלופה ברורה שיפור פוטנציאל השיטות הקיימות. אנו מסיקים כי assay הזה הוא מודל מתאים ללמוד פ ' biofilm aeruginosa אוכלוסיות. בדיקות נוספות במסגרות קליניות היה לברר אם רגישויות אנטיביוטיות על בסיס biofilm, גדל פ aeruginosa יכול להוביל לבחירות אנטיביוטיות שונות עם תוצאות מיקרוביולוגיות וקליניים שיפור פוטנציאלי. חקירות דומות תוך שימוש במודלים הקלאסיים biofilm הראו כי ערכי BSMIC להובילהמלצות שונות לטיפול אנטיביוטי 5,17.

בנוסף בדיקת היעילות של אנטי זיהומיות סוכנים, מערכת ASM מייצג אלטרנטיבה זולה, פשוטה לשחזור כדי בבעלי חיים ללימודים כגון אלה להבנת פיזור פ aeruginosa אוכלוסיות. ראינו הטרוגניות רב האוכלוסיות הטבעיות של פ ' aeruginosa התאושש CF המטופלת ספוטה 18, 19. גיוון פנוטיפי ו genotypic דומה ניתן לראות במהלך הצמיחה ASM 4 (נתונים שלא פורסמו שלנו), מה שהופך אותו אטרקטיבי במודל חוץ גופית התנאים ריאות CF. הפשטות היחסית של המודל ASM מקל לתכנן לטווח ארוך ניסויים התאמה מכוונת, למשל, על ניטור ההשפעות של אנטיביוטיקה או לחצים אחרים על פ ' האוכלוסייה aeruginosa סטייה. בנוסף, חיידקים פתוגנים נוספים ניתן לגדלASM. לדוגמה, Fouhy et al. 2007 השתמשו ASM ללמוד היווצרות biofilm ש ' maltophillia 20.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים את תמיכתם של בריטניה המכון הלאומי לחקר הבריאות, ד"ר Hadwen אמון למחקר להומניות, מובילה הצדקה רפואית בבריטניה למימון מחקר בלעדי שאינם מהחי שיטות מחקר כדי להחליף ניסויים בבעלי חיים, ואת האמון Wellcome (גרנט 089215). כמו כן, אנו מכירים נוברטיס פרמצבטיקה בריטניה בע"מ (בלתי מוגבל החינוך מענק).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl BDH BDH0258
KOH BDH BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma L2897
96-well microtitre plates Sarstedt 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxoid CN0025
Microaerophilic chamber Oxoid HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 BDH BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
  2. Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
  3. Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
  4. Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
  5. Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
  6. Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
  7. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
  8. Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
  9. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
  10. Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
  11. Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
  12. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
  13. Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
  14. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
  15. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
  16. Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
  17. Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
  18. Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).
  19. Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
  20. Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
  21. Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
  22. Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).

Tags

Artificial Sputum MediumAntibiotic EfficacyPseudomonas AeruginosaCystic Fibrosis LungIn Vitro Antimicrobial Susceptibility TestsMicroaerophilic ConditionsBiofilmsArtificial Sputum Medium AssayMicrotitre-plate AssayAntimicrobial Susceptibility

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image