Uso di un terreno dell'espettorato artificiale per testare l'efficacia degli antibiotici contro<em> Pseudomonas aeruginosa</em> In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

1. Preparazione del mezzo dell'espettorato artificiale (ASM) Aggiungere 4 g di DNA da sperma di pesce a 250 ml di acqua sterile molto lentamente in un periodo di diverse ore. Il DNA richiede diverse ore per sciogliere completamente e può essere agitata per una notte a temperatura ambiente. Aggiungere 5 g mucina da suini allo stomaco (tipo II) lentamente a 250 ml di acqua sterile fino a quando la mucina è sciolto completamente. La soluzione può essere agitata per una notte a 4 ° C. Sciogliere 0,25 g di ciascun essenziali e non essenziali L-amminoacido, con l'eccezione di L-tirosina e L-cisteina, in 100 ml di acqua sterile. Sciogliere 0,25 g di L-cisteina in 25 ml di idrossido di potassio 0,5 M (M r 56,11 g / mol) e 0,25 g di L-tirosina in 25 ml di acqua sterile. Sciogliere 5,9 mg di acido diethylenetriaminepentaacetic (DTPA), 5 g di NaCl e 2,2 g di KCl in 100 ml di acqua sterile. Combinare il DNA, mucina, L-amminoacidi, DTPA, NaCl e KCl in una bottiglia 1 litro. Aggiungere 5 ml di tuorlo d'uovo emulsion e riempimento a circa 850 ml con acqua sterile. Regolare il pH a 6,9 con 1 M Tris (pH 8,5, M r 121,14) e portare il volume di 1 litro con acqua sterile. Sterilizzare la ASM per filtrazione usando un ME Vacuubrand 2 pompa da vuoto a membrana e Millipore Steritop unità filtranti con pori e le dimensioni del collo di 0,22 micron e 45 mm, rispettivamente. Ogni unità Steritop filtro può essere riutilizzato immediatamente fino a tre volte, tuttavia, i filtri devono essere risciacquato due volte con acqua sterile prima del riutilizzo. Il processo di filtrazione è lento e può essere effettuata in 2 giorni. Altre versioni di ASM sono stati sviluppati che utilizzano l'aggiunta di antibiotici, invece di filtrazione 11 Tuttavia, a causa di possibili interazioni farmacologiche, si sconsiglia il metodo per questa particolare applicazione. Filtrati e filtrata ASM deve essere conservato a 4 ° C al buio. Uso fresco ASM si raccomanda tuttavia, può essere mantenuta in queste condizioni per un massimo di un mese. </li> 2. Determinazione del Sessile concentrazione minima inibitoria cellule planctoniche Metabolica (PSMIC) Per determinare la concentrazione minima inibitoria metabolica (PSMIC) i valori per 15 planktonically cresciuta P. aeruginosa isolati, il metodo microdiluizione deve essere eseguita, come descritto nelle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12. L'antibiotico di scelta, in questo caso tobramicina solfato, è diluito in serie Luria-Bertani (LB) in media una piastra a 96 pozzetti microtiter per fornire un intervallo di concentrazione adeguato di antibiotici. Diluire culture notte di P. aeruginosa in LB ad una OD 600 di 0,05 (± 0,01) e aggiungere 100 volumi pl ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti di microtitolazione contenente 100 pl del antibiotico diluiti serialmente. In questo caso, le concentrazioni finali di tobramicina solfato compresa tra 512-0,5 ug / ml. Otto repliche di ogni antibiotic concentrazione deve essere eseguita. Pozzetti di controllo negativi per ogni isolato dovrebbe essere istituito, in cui nessun antibiotico viene aggiunto. Inoltre, dovrebbe contenere otto pozzi LB solo per l'uso come uno sbozzato durante l'analisi a valle (sezione 2.6). Incubare le piastre a 96 pozzetti microtiter per 1 – 2 giorni a 37 ° C senza agitazione in condizioni aerobiche o microaerofili (5% O 2, 10% CO 2, e 85% N 2). Condizioni microaerofili sono ottenuti utilizzando CampyGen confezioni di generazione di gas in grandi vasi anaerobici. Dopo l'incubazione, la crescita batterica è determinata misurando l'assorbanza della coltura batterica in ciascun pozzetto ad una lunghezza d'onda di 600 nm usando un lettore di micropiastre Fluostar Omega e Analysis Software MARS dati. L'assorbimento da parte trattata con antibiotici culture planctonici (A cellule antibiotiche planctonici trattati) e l'assorbimento dai controlli negativi (un controllo negativo) devono essere corretti da sottrarreione di assorbanza ottenuto dal fondo LB pozzetti contenente solo (A vuoto). L'inibizione percentuale di vitalità è successivamente calcolato come (media ± cellule antibiotiche planctonici trattate /, un controllo negativo) x 100%. Il PSMIC 90 è definita come la concentrazione di antibiotico provoca 90% di inibizione della crescita batterica planctonici. Per determinare la vitalità batterica dopo il trattamento con l'antibiotico di scelta, 10 pl di 0,02% (v / v) resazurina (diluito in acqua distillata) viene aggiunto a ciascun pozzetto e le piastre vengono incubate in condizioni aerobiche per 1 – 2 ore a 37 ° C, agitando a 150 rpm. Cellule vitali ridurrà il colorante blu resazurina alla forma resorufina rosa fluorescente. Dopo l'incubazione con resazurina, monitorare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm in un lettore di micropiastre Fluostar Omega. I dati dovrebbero essere analizzati come descritto dibassa. 3. Determinazione del Biofilm Sessile minima concentrazione inibente Cell (BSMIC) Pernottamento culture di P. aeruginosa (in questo caso, 15 isolati di P. aeruginosa sono utilizzati) deve essere diluito in LB ad una OD 600 di 0,05 (± 0,01), 1:100 quindi ulteriormente diluita in ASM fresco (volume totale 1,8 ml). Le colture diluiti (1,8 ml) deve essere aggiunto a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di coltura di tessuti trattati. Tre pozzetti devono contenere ASM solo per l'uso come uno sbozzato durante l'analisi a valle (sezione 3.9). Fissare le piastre da 24 pozzetti con laboratorio parafilm e incubare per 3 giorni in condizioni aerobiche o microaerofili a 37 ° C, agitando a 75 rpm. Condizioni microaerofili dovrebbe essere ottenuto utilizzando CampyGen confezioni di generazione di gas in grandi vasi anaerobici. Diluire l'antibiotico di scelta, in questo caso tobramicina solfato, di fornire una gamma appropriata di concentrazione in acqua dolceASM. In questo caso, le concentrazioni finali comprese tra 512-1 ug / ml. Aggiungi ciascuna concentrazione dell'antibiotico, in volumi di 200 pl, nei rispettivi pozzetti delle piastre da 24 pozzetti. Quattro repliche di ciascuna concentrazione antibiotica deve essere eseguito. Biofilm non esposte al antibiotico di scelta sono stati utilizzati come controllo negativo. Bloccare le piastre a 24 pozzetti con laboratorio parafilm e incubare in condizioni aerobiche o microaerofilo per altre 24 ore a 37 ° C, agitando a 75 rpm. Dopo incubazione in presenza dell'antibiotico di scelta, interrompere le biofilm batteriche utilizzando 100 pl di 100 mg / ml cellulasi (diluito in tampone citrato 0,05 M [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in acqua e il pH a 4,6 con NaOH] ) e incubare le piastre a 24 pozzetti in condizioni aerobiche a 37 ° C, agitando a 150 rpm per 1 h. Se necessario, biofilm potrebbe essere ulteriormente perturbato pipettando uso in questa fase. Per determinare le attività metabolichedelle cellule batteriche rilasciate dai biofilm disgregate, 100 pl di 0,02% (v / v) resazurina (diluito in acqua distillata) deve essere aggiunto a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti e incubate per 1 – 2 ore a 37 ° C , agitando a 150 rpm. Dopo l'incubazione con resazurina, misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm in un lettore di micropiastre Omega Fluostar e analisi dei dati MARS Software. Fluorescenza dalle trattata con antibiotici biofilm (F trattata con antibiotici biofilm) e fluorescenza dai controlli negativi (controllo negativo F) devono essere corretti per sottrazione di fluorescenza di fondo ottenuto dai pozzetti contenenti solo ASM (F vuoto). L'inibizione percentuale di vitalità è successivamente calcolato come (media di F biofilm trattati con antibiotici / F: controllo negativo) x 100%. Il BSMIC 90 è definita come la terapia anticoncentrazione tic causando il 90% di inibizione dell'attività metabolica. 4. Risultati rappresentativi Formazione di biofilm ASM è possibile in piccole (2 ml) volumi e le biofilm sono completamente formate entro 3 giorni (Figura 1A). Questo può essere dimostrato rigorosamente pipettando del biofilm, che dovrebbe essere difficile da interrompere. I microcolonie sono paragonabili a quelli cresciuti in volumi maggiori 4 (figura 1B). Figura 2 mostra le principali differenze tra le cellule coltivate planktonically e in un biofilm rilevata da analisi di immagine al microscopio elettronico. Culture biofilm mostrano chiaramente i livelli considerevoli di matrice extracellulare che circonda le cellule e le strutture dei singoli all'interno del biofilm sono difficili da identificare. Diversi studi suggeriscono che lo stile di vita biofilm può influenzare la suscettibilità agli antibiotici 13, 14. Il nostro piccolo saggio di scala ASM può essere utilizzato per determine la BSMIC di antibiotici multipli per isolati multipli contemporaneamente. Il flusso del saggio è mostrato in Figura 3. L'effetto di antibiotici sulla vitalità cellulare batterica può essere misurata usando il saggio resazurina. Antibiotici, in questo caso tobramicina, può essere aggiunto al biofilm stabilito e incubate per 24 h. Dopo questo il biofilm è interrotta e resazurina viene aggiunto. Cellule metabolicamente attive può ridurre il colorante resazurina conseguente cambiamento di colore dal blu (resazurina) al rosa (resorufina) 15. Figura 4A mostra un saggio esempio in cui P. aeruginosa è stata incubata con differenti concentrazioni di tobramicina prima interruzione biofilm e aggiunta di resazurina in una piastra di microtitolazione. Il blu non fluorescenti colore indica cellule non vitali, mentre le cellule vitali di ridurre il colorante alla forma rosa fluorescente, resorufina. Lo SMIC può quindi essere calcolata convertendo fluorescenza in percentualerimanente vitalità batterica. Figura 4B mostra la variazione vitalità% con concentrazione crescente tobramicina. 10% di redditività è stato scelto come cut-off al fine di calcolare la SMIC 90. In condizioni aerobiche, tobramicina SMIC i 90 valori sono superiori per le cellule coltivate come biofilm da quelli delle culture planctonici. La tabella 1 mostra la variazione in PSMIC BSMIC 90 e 90 per tutti gli isolati testati. Tabella 2 mostra che in condizioni aerobiche, un drammatico aumento della resistenza alla tobramicina (2 a> 32 volte maggiore in SMIC) è stato osservato per la maggior parte degli isolati, quando coltivate in ASM (biofilm mode) rispetto a LB (modalità planctonico). Inoltre, biofilm coltivate in condizioni microaerofili esposto uno SMIC maggiore tra 2 e> 128-volte rispetto ai biofilm cresciuti in condizioni aerobiche. Figura1. Formazione di biofilm di P. aeruginosa in ASM P. ceppo aeruginosa PAO1 forma grumi macroscopicamente visibili (microcolonie) quando coltivate in ASM. A, la formazione di biofilm in 30 ml culture ASM (grande) dopo 7 giorni in crescita tappo a vite in vetro Duran fiaschi. B, la formazione di biofilm in 2 ml culture ASM ( piccola scala) dopo 3 giorni di crescita in piastre da 24 pozzetti di polistirene. Figura 2. Micrografie TEM di biofilm ASM A / C al microscopio TEM (x; 27.000) cresciuti del PAO1 planktonically e in ASM, rispettivamente, B / D micrografia TEM (x57, 000) di planctonici PAO1grown ed in ASM, rispettivamente. Batteri Planktonically cresciute sono state coltivate per tutta la notte in brodo LB. I biofilm sono state coltivate per 7 giorni in 30 ml culture ASM. Frecce nere fare riferimento a celle all'interno del biofilm e le stelle si riferiscono agli spazi extracellulari. Barre di scala = 1um. Figura 3. Workflow della ASM test biofilm suscettibilità agli antibiotici. Figura 4. L'uso della resazurina per la determinazione della suscettibilità di antibiotici sono state incubate cellule batteriche con differenti concentrazioni di antibiotico e l'attività metabolica rimanente è stata determinata utilizzando resazurina. A, il blu non fluorescente forma ossidata di resazurina indica cellule non vitali e si riduce metabolica cellule attive al rosa fluorescente resorufina. B, l'intensità di fluorescenza viene convertito in percentuale di rimanere vitalità batterica. 10% di redditività è stato scelto come cut-off al fine di calcolare la MSMIC90. Clicca qui per visualizzare larger figura. </span> Ceppi PSMIC 90 (pg / ml) 1 BSMIC 90 (pg / ml) 1 Aerobico Microaerofili 2 Aerobico Microaerofili 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemic Strain (LES) isola LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES isolati 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabella 1. Sensibilità di P. aeruginosa alla tobramicina. 1 Per la determinazione del PSMICs e BSMICs tobramicina è stata utilizzata in diluizioni seriali di 2 volte vanno 512-0,5 mg / ml (n = 8 per ciascuna concentrazione) e 512-1 pg / ml (n = 4 per ciascun concentrazione), rispettivamente;; PSMICs sono stati determinati usando lo standard microdiluizione metodo 1. 2 condizioni microaerofili erano del 5% O 2, 10% CO 2, e 85% N 2. Sforzo PSMIC 90/90 BSMIC fold change 1 PSMIC aerobica → PSMIC microaerofilo BSMIC aerobica → BSMIC microaerofilo PSMIC aerobica → BSMIC aerobica PSMIC microaerofilo → BSMIC microaerofilo PAO1 0 > 64 2 128 LES isola LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 </td> 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES isolati 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 </td> 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabella 2. Fold change di PSMICs e BSMICs alla tobramicina. 1 ND, non determinati, valori in grassetto indicano le modifiche SMIC piega> 10.