Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri<em> Drosophila</em> Larva
Summary
Bu yazıda, tayinlerde termal nosisepsiyon çalışma göstermek<em> Drosophila</em> Larva. Bir test termal nosiseptörleri (yerel) mekansal kısıtlı stimülasyonu gerektirir<sup> 1,2</sup> Ise ikinci en toptan (global) aktivasyonu veya bütün bu nöronlar içerir<sup> 3</sup>. Hep birlikte, bu tekniklerin davranışsal işlevlerin görselleştirme ve miktar izin<em> Drosophila</em> Nosiseptif duyu nöronlarının.
Abstract
Bu yazıda, Drosophila larva termal nosisepsiyon okumak için testler göstermektedir. Ikinci en toptan (global) aktivasyonu veya bütün bu nöronlar 3 içerirken Bir tahlil termal nosiseptörleri 1,2 (yerel) mekansal kısıtlı stimülasyon içerir. Birlikte, bu teknikler Drosophila nosiseptif duyu nöronlarının davranışsal işlevlerin görüntülenmesi ve ölçümü sağlar.
Drosophila larva termal nosisepsiyon, evrimsel türler 1,2 arasında korunur zararlı sıcaklıklara duyusal yanıt çalışmak için kurulmuş bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmaların Drosophila avantajları düzelen, tüm metazoans olduğu gibi, bu sinir sisteminin göreceli olarak basit ve Drosophila yatan biyolojisi 4-6 moleküler temeli incelemek için kullanılabilir genetik teknikler sofistike olanzehirli termal uyarılara e genellikle sunulan uyaran 7 için bir "nocifensive" itici çekilmesi içerir. Bu tür uyaranlar serbest sinir uçları veya nosiseptörleri aracılığı ile algılanır ve organizma yanıt genlik zararlı uyaranın 8 alma nosiseptörlerin sayısına bağlıdır edilir. Drosophila, bu fotoreseptör 10 olarak yeni keşfedilen rolüne ek olarak zararlı termal ve mekanik uyarıcılar 9 algılamak sınıf IV dendritik arborization duyusal nöronlar. Çok iyi gelişim düzeyinde incelenmiştir bu nöronlar, epidermal bariyer tabaka üzerine arborize ve 11,12 neredeyse tüm epidermal hücreler ile temas edin. Bu ikinci derece nöronlar bağlanabilir merkezi sinir sistemi 11 ventral sinir kordonu içine her sınıf IV nöron projelerin tek akson bu beyin projesi.
Bazal koşullar altında, nosiseptif duyu nöronispeten yüksek bir eşik ulaşılana kadar ns yanmaz. Burada anlatılan testler araştırmacı temel davranışsal tepkileri ya da, muhtemelen, aşağıdaki doku hasarı gelişir sensitizasyon. Ölçmek için izin Her test zararlı termal uyaranlara farklı ama ilişkili lokomotor davranışsal tepkileri kışkırtır ve Drosophila larva termal nosisepsiyon çeşitli yönleriyle görselleştirmek ve ölçmek için araştırmacı izin verir. Testler istenilen genotiplerinin larva veya nosisepsiyon etkileyebilecek farklı çevresel koşullar altında büyüdü larva uygulanabilir. Termal nosisepsiyon türler arasında korunmuş olduğundan, Drosophila da genetik ayrımında toplanan bulgular olasılıkla omurgalılar dahil, diğer türlerde de termal nosisepsiyon anlayışımızı bilgilendirecektir.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan deneyleri kalitatif ve kantitatif olarak zararlı termal uyaranlara yanıt için farklı genotipleri larvaları değerlendirmek için kullanılabilir. Isı prob assay of bir ana özelliği uyaran yalnızca tek bir loküsündeki verilir olmasıdır. Bu, muhtemelen belki de sadece küçük bir prob ile iletişim segmentinde sınıf IV nöronlar-olanlar alt ve hemen komşu segment 11 bulunanların ateş neden olur. Çünkü yerel stimülasyon, ısı probu test bölgeye böyle bir sıcak soba başvurmadan bir el gibi belirli bir vücut için lokalize bir zararlı uyaran tespit ortak duyusal deneyimi taklit eder. I)) kullanıcı larva için prob uygulandığı ile basınç, ii prob hassas konum: ısı probu testin dezavantajı ise muhtemelen şu üç faktörden kaynaklanıyor olabilir bazı kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır altta yatan nosiseptif nöronlar, ve, iii) hassas ang göre larva onle hangi prob temas larva yüzeyinde.
Biz daha önce verilen bir sıcaklıkta 1 olarak çekmede gecikme dayalı cevaps, yavaş yanıt ve hızlı yanıt kategorize larvalarının nicel bir strateji bildirdi. Burada da yüksek sıcaklıklarda larva yanıt rapor. İlginçtir, biz larva termal nosiseptif yanıtları için bir tavan olduğunu bulmak ve bu tavan 52 ve 54 arasında yattığını ° C Bu geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) 52 daha yüksek sıcaklıklarda yolluk yeteneğine kanal ° C'ye sahip olmadığı larva gösterebilir Alternatif olarak, kullanılan nöronlar veya kasları başlatmak veya onlar bile caydırıcı yoksunluk içinde çalışabilmesi için önce motor yanıt hasar yürütmek olduğunu hatırlatıyoruz. Ayrıca, geri çekme amplitüd cevabı farklı bir analizi kullanılarak-yanıt "sağlamlığı" göstergesi olarak rulo sayısını da sunulmaktadır. Saf, birBu parametrelerin stimülasyon artan sıcaklık veya zamanla artacağı beklenebilir. Hayret, biz bu durumda olmadığını bulmak. Larva zararlı aralığı (42 ° C) düşük sonunda bir sıcaklıkta uzun süre uyarılmış daha rulo göstermek ve daha fazla zaman larvaların yüksek sıcaklıklarda (48-52 ° C) probed daha haddeleme geçirdi. Bu zehirli sıcaklığında pencere içerisinde öncelikle amplitüd cevabı belirler maruz kalma süresi olduğunu göstermektedir. Larvaları son derece zararlı sıcaklıklara maruz beri (48-52 ° C) çok hızlı bir şekilde ortalama yanıt, onlar uzun bir süre boyunca daha az zararlı sıcaklığa maruz larva gibi birçok rulo şeklinde göstermezler. Burada bildirilen yanıt genlik analizi farklı genotipleri veya çevresel manipülasyonlar göre edilebileceği birlikte başka bir nicel boyut katıyor.
Isı plakası testin bir diğer temel özelliği, zararlı bir küresel maruz içeriyor olmasıısı. Bunun gibi, bir sıcak soba dokunmadan daha ısıtma kazanı oturan hayvan daha yakındır. Bir larva bu küresel maruz davranışsal tepkileri, yerel stimülasyonu üzerine gözlenen bu daha karmaşık laboratuar, vahşi bir küresel zararlı uyaranın yaşayabilirsiniz zaman net olmamakla beraber. Ayrıca diğer 3 kaydetti ısı plakası testin bir gücü, larva dokunmadan protokolünün bir parçası değildir çünkü az kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır. Sadece önemli varyans her bir davranış başlar ve bu tekrarlanan görüş / aşinalık ile minimize edilebilir tanımlarken gibi görünüyor. Testleri arasında ilginç bir farklılık caydırıcı davranışlar başlaması hangi sıcaklıkları. Bu ısı probu ile daha ısı plakası tayininde daha düşüktür. Isı probu (baş ve kuyruk yükseltme) ile temas larva tarafından sergilenen davranış, bir ön ° C ısı plat yılında ~ 27 gözlenen baş thrash bağlılaşığı olabilire testi. Bu yanıt "acı" daha "rahatsızlık" yansıtıyor olması mümkündür. Biz bile yüksek de, nöbet kırbaçlanan bağlılaşığı ve felç gözlenen değil (en fazla 48 ° C) ısı probu test sıcaklıkları ve vücudun birden fazla bölgeden ateş duyu nöron kritik bir kütle olduğunu olabilir Bu davranışları getirmek gerekiyordu. Küresel stimülasyon yerel davranışı tetiklemek için yeterli değildir nöronal yanıtlar toplanarak içerebilir gösteren ısı probu ile gözlenen nosiseptif eşik alt ucunun altına – İlginçtir, nöbet ve felç davranışları sıcaklıklarda (37 ° C ~ 34) gözlemlenmiştir ısı probu uygulaması. Bu sıcaklıklarda aslında larvaları için zararlı olarak algılanan bu çoğu durumda değilsiniz felç davranışı başlar ve daha sonra sinek gıda kurtarmak için izin verilen larvaları (Şekil 5C) hayatta olduğu gözlem tarafından desteklenmektedir. Ayrıca argümanı destekleyen bu ısı plyedik tahlil nosiseptif tepkiler okuyor bilinen nosiseptif duyu nöronlar sinaptik iletimi bloke gözlemlenen davranışları (Şekil 6) çoğunun gecikme artırdığı bir gerçektir. Yüksek sıcaklık kırbaçlanan davranış için gecikme hiçbir artış olmadığını gözlem md-gal4 ifade değil diğer duyusal nöronları bu davranışı için gerekli olabileceğini düşündürmektedir.
Küresel tayininde hızlı ısıtma suyu bir damla yerel tahlil ve daldırma küçük bir metal prob tüyosu – Özetle, her iki çalışma tanımlanan sıcaklık bir zararlı termal uyarana bireyin larva açığa içerir. Genetik geçmişleri ve / veya değişen çevre koşulları (örneğin artı ya da eksi doku hasarı için) değişen maruz kalan Drosophila larva davranışsal tepkiler, okudu ve bu testler kullanılarak ölçülebilir. Sonuçta, bu testlerin sonuçlarının daha iyi noc kontrol genetik ağları anlamanıza yardımcı olacaktırDrosophila ve ilgili diğer türler iception.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma için ısı plakası tayini, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyeleri öneren larva ısı probu tayini, Sean Sweeney geliştirmek için ısı probu tasarımı, Daniel Babcock için Hıristiyan Landry teşekkür ederim. Bu çalışma MJG ve araştırma kariyerleri (AVG) azınlık erişim için bir NIH MARC U-STAR Eğitim Grant (Houston-Downtown Alimler Akademisi Üniversitesi T34GM079088) ile NIH R01 NS069828 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | FST | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors–noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
