المحلية والعالمية طرق تقييم Nociception الحرارية في<em> ذبابة الفاكهة</em> يرقات
Summary
في هذه المقالة، علينا أن نبرهن فحوصات لدراسة nociception الحرارية في<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات. واحد ينطوي على فحص التحفيز مكانيا المقيد (المحلية) من nociceptors الحرارية<sup> 1،2</sup> في حين أن الثاني ينطوي على جملة (عالمي) تفعيل معظم أو كل هذه الخلايا العصبية<sup> 3</sup>. معا، وهذه التقنيات تسمح التصور وتقدير من وظائف السلوكية لل<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية الحسية nociceptive.
Abstract
في هذه المقالة، علينا أن نبرهن فحوصات لدراسة nociception الحرارية في يرقات ذبابة الفاكهة. واحد ينطوي على فحص التحفيز مكانيا المقيد (المحلية) من 1،2 nociceptors الحرارية في حين أن الثاني ينطوي على جملة (عالمي) تفعيل معظم أو كل هذه الخلايا العصبية 3. معا، وهذه التقنيات تسمح التصور وتقدير من وظائف الخلايا العصبية السلوكية لذبابة الفاكهة الحسية nociceptive.
اليرقة ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي لدراسة تأسيس nociception الحرارية، واستجابة حسية لدرجات الحرارة يمكن أن تكون ضارة التي يتم حفظها عبر تطويريا 1،2 الأنواع. مزايا ذبابة الفاكهة لمثل هذه الدراسات هي البساطة النسبية لنظامها العصبي ومدى تطور التقنيات الجينية التي يمكن استخدامها لشرح الأساس الجزيئي للبيولوجيا الأساسية 4-6 في ذبابة الفاكهة، كما هو الحال في جميع metazoans، على رده للمؤثرات الحرارية الضارة عموما ينطوي على "nocifensive" انسحاب مكره على التحفيز قدم 7. يتم الكشف عن مثل هذه المحفزات من خلال نهايات عصبية حرة أو nociceptors والسعة للاستجابة العضوي يعتمد على عدد من nociceptors تلقي الحوافز الضارة 8. في ذبابة الفاكهة، فإن الخلايا العصبية الجذعية الرابع تشجر فئة الحسية التي تكشف عن المنبهات الضارة الحرارية والميكانيكية 9 في إضافة إلى دورها اكتشفت مؤخرا كما مبصرات 10. هذه الخلايا العصبية، والتي تم دراستها بشكل جيد للغاية على الصعيد التنموي، arborize على ورقة حاجز البشرة، وإجراء اتصالات مع جميع خلايا البشرة 11،12 تقريبا. محور عصبي واحد من كل فئة مشاريع الخلايا العصبية في النخاع الرابع الاعصاب الاماميه من الجهاز العصبي المركزي 11 حيث قد وصل إلى الدرجة الثانية الخلايا العصبية التي المشروع الى الدماغ.
في ظل ظروف خط الأساس، والاعصاب الحسية nociceptiveوسوف يتم إطلاق نطاق حتى يتم التوصل إلى عتبة مرتفعة نسبيا. والمقايسات وصفها هنا السماح للمحقق لقياس الاستجابات السلوكية أو خط الأساس، ويفترض،. توعية تستتبعه التالية تلف الأنسجة كل فحص يثير متميزة ولكنها ذات صلة الاستجابات السلوكية locomotory للمؤثرات الحرارية الضارة ويسمح الباحث إلى تصور وقياس مختلف جوانب nociception الحرارية في يرقات ذبابة الفاكهة. يمكن تطبيق فحوصات على اليرقات من المورثات المطلوب أو إلى اليرقات التي أثيرت في ظل الظروف البيئية المختلفة التي قد تؤثر على nociception. منذ يتم حفظها nociception الحراري عبر الأنواع، فإن النتائج المستقاة من تشريح الجيني في ذبابة الفاكهة إبلاغ المرجح فهمنا للnociception الحرارية في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الفقاريات.
Protocol
Discussion
يمكن استخدام المقايسات وصفها هنا لنوعيا وكميا تقييم اليرقات من المورثات مختلفة للاستجابة للمؤثرات الحرارية الضارة. والسمة الرئيسية للحرارة فحص التحقيق هو أن يتم إعطاء الحوافز فقط في مكان واحد. وهذا يؤدي على الارجح لاطلاق النار من مجموعة فرعية صغيرة فقط من الصف الرابع منها الخلايا العصبية في الجزء اتصلت به لجنة التحقيق، وربما تلك الموجودة في قطاعات فورا المجاورة 11. بسبب تحفيز المحلية، وفحص مسبار الحرارة يحاكي تجربة مشتركة للكشف الحسي حافزا الضارة التي يتم ترجمتها إلى هيئة خاصة مثل المنطقة من ناحية الاتصال موقد ساخن. والعيب من الحرارة فحص التحقيق هو أن لديها بعض التقلبات المستخدم إلى المستخدم الذي يمكن من المحتمل أن يعزى إلى ثلاثة عوامل هي: ط) مع الضغط الذي ينطبق على المستخدم لجنة التحقيق إلى يرقة، والثاني) والموقع الدقيق للمسبار على يرقة نسبة إلى الخلايا العصبية في nociceptive الكامنة، والثالث) وانج دقيقةجنيه مصري في لجنة التحقيق التي اتصالات سطح يرقة.
ذكرنا سابقا استراتيجية كمية من اليرقات في تصنيف غير المستجيبين، المستجيبين بطيئة، والمستجيبين بسرعة على أساس الكمون انسحابها إلى درجة حرارة معينة 1. نحن هنا تقريرا عن استجابة اليرقات لدرجات حرارة أعلى من ذلك. ومن المثير للاهتمام، نجد أن هناك سقف للاستجابات اليرقات nociceptive الحرارية وأن هذا السقف تقع بين 52 و 54 درجة مئوية. قد يشير هذا إلى أن اليرقات لا تمتلك مستقبلات محتملة عابرة (الحزب) قادر على قناة المعزولة في درجات حرارة أعلى من 52 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يمكن أن تشير إلى أن الخلايا العصبية أو العضلات المستخدمة لبدء أو تنفيذ استجابة محرك تتلف قبل أن يتمكنوا من أداء وظائفها حتى في انسحاب مكره. نحن التقرير أيضا تحليلا مختلفة من السعة للانسحاب من الاستجابة باستخدام عدد لفات كمؤشر على "متانة" للاستجابة. بسذاجة، واحدأتوقع أن هذه المعايير من شأنه أن يزيد مع زيادة درجة الحرارة أو وقت من التحفيز. من المستغرب أن نجد أن هذا ليس هو الحال. اليرقات حفز لفترة أطول في درجات حرارة منخفضة في نهاية نطاق الضارة (42 درجة مئوية) تظهر أكثر وأكثر لفات الوقت الذي يقضيه المتداول من اليرقات وبحث في ارتفاع درجات الحرارة (48-52 درجة مئوية). هذا يشير إلى أن درجة الحرارة داخل نافذة الضارة هو في المقام الأول على مدة التعرض الذي يحدد السعة للاستجابة. منذ اليرقات تتعرض لدرجات حرارة عالية الضارة (48-52 درجة مئوية) في المتوسط تستجيب بشكل سريع جدا، فهي لا تظهر كما فات العديد من اليرقات تتعرض لدرجة حرارة أقل الضارة لفترة أطول فترة من الوقت. تحليل مدى استجابة ذكرت هنا يضيف بعدا آخر على طول الكمية التي يمكن مقارنتها المورثات مختلفة أو التلاعب البيئية.
والسمة الرئيسية للحرارة لوحة الفحص هو أنه ينطوي على التعرض العالمي للالضارةالحرارة. على هذا النحو، هو أقرب إلى الحيوان يجلس في مرجل التدفئة من لمس موقد ساخن. على الرغم من أنه ليس واضحا عندما اليرقة قد تواجه حافزا الضارة على مستوى العالم في البرية، في المختبر الاستجابات السلوكية لهذا التعرض العالمية هي أكثر تعقيدا من تلك التي لوحظت على التحفيز المحلية. وقوة من الحرارة فحص لوحة، لاحظت أيضا من قبل الآخرين 3، هو أنه لا يملك الا القليل من قبل المستخدم إلى المستخدم تقلب منذ لمس يرقة ليست عنصرا من البروتوكول. الفرق الوحيد الكبير ويبدو أن في تحديد متى تبدأ كل سلوك ويمكن التقليل من هذا مع عرض المتكرر / ألفة. فرق مثيرة للاهتمام بين المقايسات هو في درجات الحرارة التي تبدأ السلوكيات مكره. وهذه هي أقل من ذلك بكثير في حرارة فحص لوحة من لجنة التحقيق مع الحرارة. قد يكون سلوك الأولية التي أظهرتها اليرقات اتصلت مع التحقيق الحرارة (رئيس ورفع الذيل) تكون متطابقة للرئيس الحالي لوحظ في ~ 27 درجة مئوية في حرارة بلاته فحص. فمن الممكن أن هذا الرد يعكس "عدم الراحة" أكثر من "الألم". نحن لم وحظ وجود ربط من الجلد، والاستيلاء، والشلل حتى في عالية (تصل إلى 48 درجة مئوية) قد تصل درجات الحرارة في حرارة الفحص والتحقيق أن يكون كتلة حرجة من الخلايا العصبية الحسية اطلاق النار من أكثر من منطقة واحدة من الجسم هناك حاجة لتحقيق في هذه السلوكيات. ومن المثير للاهتمام، ويلاحظ والسلوكيات مصادرة والشلل في درجات الحرارة (~ 34-37 درجة مئوية) تحت نهاية الجزء السفلي من عتبة nociceptive وحظ مع التحقيق الحرارة مشيرا إلى أن التحفيز العالمية قد تنطوي على جمع من الاستجابات العصبية التي هي غير كافية لتحريك السلوك مع المحلية تطبيق مسبار الحرارة. ويدعم ذلك وينظر في الواقع درجات الحرارة هذه الضارة على اليرقات بواسطة ملاحظة أن اليرقات التي تبدأ في سلوك الشلل ويسمح بعد ذلك لاسترداد على الغذاء لا يطير في معظم الحالات البقاء على قيد الحياة (الشكل 5C). مواصلة دعم الحجة القائلة بأن حرارة PLفحص يأكلون وتلا ردود nociceptive هو حقيقة أن منع انتقال متشابك في الخلايا العصبية الحسية المعروفة nociceptive يزيد من الكمون لمعظم السلوكيات الملاحظة (الشكل 6). ملاحظة أنه لا توجد زيادة في الكمون لسلوك ارتفاع درجة حرارة الجلد تشير إلى أن قد يكون مطلوبا الخلايا العصبية الحسية الأخرى التي لا تعبر عن MD-Gal4 لهذا السلوك.
وخلاصة القول، على حد سواء المقايسات تنطوي على تعريض 1 يرقة الفردية لخطة التحفيز الحراري الضارة من درجة حرارة محددة – قمة ساخنة لمجس معدني صغير في فحص المحلية والانغماس في قطرة ماء بسرعة التدفئة في فحص عالمي. الاستجابات السلوكية لليرقات ذبابة الفاكهة من مختلف الخلفيات الوراثية و / أو تعرضوا لاختلاف الظروف البيئية (على سبيل المثال زائد أو ناقص تلف الأنسجة)، يمكن دراستها وكميا باستخدام هذه المقايسات. في نهاية المطاف، وسوف ينتج عن هذه المقايسات تساعدنا على فهم أفضل الشبكات الجينية السيطرة على المؤسسة الوطنية للنفطiception في ذبابة الفاكهة والأنواع الأخرى ذات الصلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المسيحي لاندري لتصميم مسبار الحرارة، ودانيال بابكوك لتطوير مسبار الحرارة اليرقات فحص، شون سويني ليشير الى ان لوحة فحص الحرارة، ومركز بلومنغتون سهم ذبابة الفاكهة للأسهم ذبابة، وأعضاء Galko مختبر لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 NS069828 على MJG ومارك المعاهد الوطنية للصحة تحت ستار تدريب جرانت (T34GM079088 الى جامعة أكاديمية علماء هيوستن، وسط المدينة) للوصول إلى أقلية وظائف البحث (AVG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | FST | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors–noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
