Méthodes locales et globales de l'évaluation de nociception thermique dans<em> Drosophila</em> Les larves

Un contour typique des étapes expérimentales pour la préparation larves normale ou UV-sensibilisée pour les deux dosages nociception thermique est représenté sur la figure 1. 1. Préparation des larves Larves descendance mâle et la femelle d'un génotype désiré peut être testé directement. Alternativement, un croisement génétique peut être mis en place pour obtenir des larves descendance d'un génotype d'intérêt défini. Mettre en place des croix dans des bouteilles contenant de la nourriture volée en utilisant 20-30 femelles vierges et les hommes 15-20. 5 jours après la ponte, la récolte et propre au début des larves du troisième stade larvaire en creusant la nourriture volée molle et légèrement tendu à l'eau courante à travers un 630 um (taille des pores) mailles. Transférer le début de larves de troisième stade (~ 3-4 mm de longueur selon l'axe antéro-postérieur) à un petit tampon humide des aliments pour prévenir la famine et la dessiccation. Si la sensibilisation nociceptive est à tester, suivez les étapes suivantes de 2,1 2.11. Si les larves sont à tester dans le absence de dommages aux tissus, passez directement à l'étape 3.1. 2. Éthérisation et l'irradiation UV Construire une chambre éthérisation. Coupez le fond d'un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Avec une spatule en métal à chaud faire fondre le bord coupé du microtube. Apposer une maille fine à la surface du tube fondu et laisser refroidir. La chambre éthérisation permettra l'entrée de fumées d'éther, mais empêcher l'évasion des larves. Utilisez une pince ou d'un pinceau à placer doucement 10 larves au début troisième stade intérieur d'une chambre éthérisation home-made. Larves lieu le long de la face intérieure du couvercle et fermer. Remarque: Les deux prochaines étapes doivent être effectuées sous une hotte que l'éther est un produit chimique est potentiellement explosive et ses vapeurs peuvent anesthésier un être humain ainsi que d'une larve. Placez la chambre éthérisation contenant des larves de l'intérieur d'un tube de Coplin contenant un bécher de 10 ml portant unboule de coton imbibée de ~ 1,5 ml d'éther diéthylique. Vissez le bouchon du tube de Coplin pour exposer les larves à des vapeurs d'éther de 2 à 2,5 minutes. Notez que les délais éthérisation plus susceptibles de nuire à la survie ou le comportement des larves. Après éthérisation, retirez la chambre de l'éthérisation Coplin jar / bécher, donnant quelques secondes dans la hotte pour les vapeurs d'éther de dissiper. Vous pouvez maintenant déplacer de la hotte de retour au laboratoire. Utilisez un vaporisateur d'eau pour rincer doucement larves de la chambre de éthérisation dans une petite boîte de Petri. Utilisez une pince et un Kimwipe pour effacer les larves anesthésié sec et délicatement les apposer côté dorsal sur une bande de scotch double-face fixée à un 3 "x 1" lame de microscope en verre. Placer la lame sur la surface inférieure d'une chambre d'irradiation UV et exposer les larves à une lumière UV pendant 6 secondes à 20 mJ / cm 2 d'intensité. Immerger la lame dans l'eau pour flotter doucement les larves hors du scotc recto-versobande h. Utilisez une pince ou d'un pinceau à placer délicatement les larves irradiées dans un 15 x 45 mm un flacon en verre contenant la culture dram ~ 1,0 ml de nourriture volée où ils peuvent récupérer pour une période de temps variable (8 -24 heures) à 25 ° C ou autre température de la culture désirée avant de re-récolte pour les essais thermiques nociception. 3. Local test sonde thermique Nous livrons un stimulus nociceptif thermique à un segment de corps de la larve individuelle à l'aide d'une sonde thermique sur mesure fabriqué par Pro-Dev génie (voir le tableau des matériaux). Bien que cette sonde possède des caractéristiques de conception optimales (une pointe en métal petite ~ 0,07 mm 2 de surface et la capacité de maintenir avec précision une température de consigne de 23 ° C à 65 ° C), en principe, n'importe quel outil avec une petite astuce qui peut être chauffée à une température définie pendant une période pouvant aller jusqu'à 20 secondes devrait suffire. La pointe de la sonde est utilisée pour stimuler début 3 ème stade larvaire précisément sur ​​la face dorsaleligne médiane à l A4 segment abdominal (voir Figure 2). En réponse à ce stimulus thermique, les larves se présentent généralement un comportement de retrait du matériel aversif latéralement par 360 degrés ou plus. Ce comportement est distinct de leur réponse au toucher la lumière à une sonde non-nocive à température ambiante en métal ce qui implique généralement une courte pause dans leur activité locomotrice 13. Protocole pour le dosage sonde thermique: Température pré-réglée de la sonde thermique pour point de consigne désiré. Utilisez un pinceau ou une pince doucement transférer une larve individuelle sur une plate-forme plane (nous avons l'habitude d'utiliser un petit morceau de coupe de vinyle à partir d'un liant) sur lequel les larves seront ensuite stimulé. La larve doit être couvert par une mince pellicule d'eau avant le contact avec la sonde thermique. Le film d'eau recouvrant la larve doit être aussi peu que possible et couvrir complètement la larve, tout en s'assurant que la larve n'est pas sèche lorsque vous touchez le vinyle. Appuyez doucement sur ​​le bout de la sonde contre la larve au segment de A4 appliquant une légère pression avec le bout à environ un angle de 45 ° entre la sonde et la surface de la larve (voir Figure 2). La pression devrait provoquer un léger renfoncement sur la surface de la larve et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion. Si la larve continue à se déplacer, appliquer une pression un peu plus et il sera généralement arrêter. Ne pas enregistrer les données de larves qui se déplacent au-delà du champ de vision ou pour lesquels sonde de contact constante ne peut pas être obtenus jusqu'à ce qu'une réponse ou de coupure de 20 s. Continuer à stimuler la larve jusqu'à ce qu'une réponse de retrait est exposée ou jusqu'à ce que le seuil de 20 secondes est atteint, selon la première éventualité. Répondant larves généralement d'abord montrer un comportement préliminaire de soulever la tête et la queue. Ceci est généralement suivi par le comportement de retrait du matériel au moins 360 degrés. Seul un rouleau complet de 360 ​​degrés est marqué comme un comportement nocifensive (la HEA préliminaired ou relance la queue n'est pas). Une fois que le comportement de retrait est amorcé le contact avec la sonde communiqué et d'enregistrer le temps de latence ou le temps de retrait. Si aucun comportement de retrait est observé dans les 20 secondes, puis la larve est un non-répondeurs. Les intervenants peuvent être divisés en 2 catégories. Si le comportement de retrait est montré dans les 5 secondes, puis la larve est un fast-répondeur. Si le comportement de retrait est indiqué entre 5-20 secondes, puis la larve est un répondeur lente (voir la figure 1 dans l'affaire Babcock, et al. 2009) 1. 4. Mondial dosage de chaleur à plaques Le dosage de chaleur à plaques a été conçu pour mesurer la nociception thermique larves de drosophile où l'animal entier est confronté à un stimulus nociceptif thermique. Individuelle 3 ème mi stade larvaire sont placés dans une baisse de 80 pi d'eau sur un plat de 60 x 15 mm Petri – voir la figure 3 pour schéma et des photos de l'ensemble testvers le haut. La boîte de Pétri est ensuite placé sur un bloc de chauffage solide (dénommé le "plaque chauffante"). Comme la température des hausses de goutte d'eau, la larve présente une série de cinq comportements stéréotypés que nous avons appelées thrash tête, rouleau, le fouet, la saisie, et la paralysie. Comme ces comportements sont dans une certaine mesure en fonction de la température de consigne de la plaque de la chaleur et le volume d'eau dans laquelle la larve est immergé nous présentons ici ce que nous avons trouvé pour être les conditions optimales (95 ° C de chaleur à plaques, 80 pl baisse de l'eau) pour l'observation de tous les 5 des comportements avec un chevauchement minimal entre eux. Protocole pour le dosage de chaleur à plaques: Positionnez les guides éclairage à fibres optiques pour assurer qu'il y ait suffisamment d'éclairage à haut contraste pour l'affichage de la larve. Utilisez une larve de test si nécessaire. La puissance doit être allumé basse pour éviter la chaleur ambiante sur la chenille à tester. Placez le bloc de chauffage dans la plaque de la chaleur avec une surface plane et placez la plaque de la chaleur surla base du microscope. Tournez sur la plaque chauffante à la position «HIGH», prévoir environ 15 minutes pour la température se stabilise, et ajuster en conséquence pour atteindre une température de surface de 95 ° C. Mesurer 80 ul d'eau distillée et placer la goutte d'eau dans le milieu de la 60 x 15 mm boîte de Pétri en polystyrène avec une micropipette. Utilisez une pince pour déposer délicatement un chiffon propre 3 ème mi stade larvaire dans le milieu de la goutte d'eau. Tenter de transférer la larve avec le volume minimal possible de l'eau de sorte que la goutte d'être chauffé reste aussi proche que possible de l'original 80 pl. Placez délicatement la boîte de Petri contenant la goutte d'eau et la larve sur le bloc de chauffage solide sur la plaque chauffante. Ajuster rapidement l'emplacement de la cuvette afin de la chenille et toute goutte d'eau sont en vue. Voir Figure 3 et vidéos 1-6. Démarrer le temporisateur au moment de la boîte de Petri est placé sur le bloc de chauffage solide de la plaque thermique et enregistrermoment de l'apparition de chaque comportement. Si vous le souhaitez, les comportements peuvent aussi être vidéo enregistrée – Voir Vidéos 1-5 pour des exemples représentatifs de chaque comportement. Logiciel Leica version 3.7 a été utilisé pour enregistrer les films, mode d'enregistrement était «en continu», un appareil photo 3 mégapixels de résolution a été (nous avons utilisé 0.63x zoom avec lequel la résolution de l'image calculée est de 10 um / pixel) et images / seconde s'établissait à 44,5. 5. Les résultats représentatifs Local test de la sonde de chaleur: En contact avec la sonde thermique, une larve montre typiquement un comportement préliminaire de la levée de sa tête et la queue. Typiquement, le soulèvement de la tête est considérée en premier, suivi par la levée de la queue. Quelques secondes après ce comportement préliminaire de la larve commence habituellement rouler latéralement que nous appelons le «comportement de retrait aversif." Le temps au bout duquel le comportement préliminaire ou le comportement de retrait est présentées peuvent varier selon la température ou gefond magnétique. Dans notre étude initiale, nous avons mesuré le pourcentage de larves présentant un retrait aversif à des températures différentes sondes de point de consigne et a constaté que 48 ° C était la plus basse température à laquelle toutes les larves ont répondu rapidement (<5 s). Ici, nous disent qu'il ya un plafond à la réponse nociception thermique des larves (figure 4A). 100% plus rapide intervenants sont observés jusqu'à une température de la sonde de 52 ° C. Cependant, à 54 ° C et plus, 90% ou plus des larves ne réagissent pas, même après 20 s de contact. Ces larves ne continuera à faire progresser la suite de la coupure de 20 s. Comme indiqué précédemment 1, les catégories de comportement de retrait à chaque température peuvent être tracées et comparées statistiquement. Étant donné qu'il s'agit d'un test comportemental existe une certaine variabilité de la larve à la larve et entre les utilisateurs individuels. Pour tenir compte de ce que nous mesurons habituellement 3 ensembles de 30 larves par condition de test. En plus de la catégorisation simple de witemps de latence thdrawal que nous avons indiqué précédemment, nous rapportons ici que l'amplitude (nombre de rouleaux ou de temps passé dans le comportement de retrait aversif) peut également être mesurée (voir figure 4). Étonnamment, il semble y avoir une relation inverse entre la température d'entrée et de la robustesse de la réponse, parce que des températures plus basses semblent provoquer un plus grand nombre de rouleaux (figure 4B) et plus de temps passé en retrait aversif (données non présentées). Cela peut indiquer que la durée d'exposition à une température nocif peut être le principal déterminant de la robustesse. Essai de chaleur à plaques: Cinq comportements stéréotypés locomoteurs sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau à la plaque de la chaleur. Elles sont décrites ci-dessous et montré dans la vidéo avec le comportement typique d'une larve de locomotion non chauffé dans de l'eau. Les latences moyennes au cours de laquelle ces comportements sont observés sont présentés dans la figure 5A, comme le sont les températures moyennes mesurées goutte d'eau pour chaque temps de latence. Dans les conditions optimales de dosage présentées ici le pourcentage de larves montrant chaque comportement distinct variait de 77 à 100% (figure 5B), bien que de temps en temps les comportements de roulement et le fouet sont omis, le chevauchement, ou se produire dans l'ordre inverse. Les comportements observés, dans l'ordre chronologique, sont décrites comme suit, et peut être regardé dans la vidéo aux heures indiquées ci-dessous: Mouvement normal en l'absence de la chaleur: la locomotion péristaltique accompagnée par la recherche des mouvements de tête. Voir la vidéo de 6:27. Thrash chef: se déplace la tête de Larve rapidement dans un mouvement vers l'avant ou latérale. Ce mouvement est similaire à leur locomotion normale dans l'eau (voir vidéo 1), mais se produit plus par à-coups et de façon persistante. Voir la vidéo de 6:40. Rouleau: Larve roule latéralement au moins à 360 °. Voir la vidéo de 6:50. Cela peut se produireun nombre variable de fois et se traduit parfois par des rouleaux incomplètes. Pour les fins du codage du comportement nous ne comptons pleins rouleaux à 360 °. Ce comportement est le plus similaire à celle observée avec l'application locale de la sonde thermique. Fouet: Larve expositions rapides de contraction de libération des mouvements le long de l'axe antéro-postérieur qui apportent la tête très brièvement à proximité de la queue. Voir la vidéo de 7:11. Correction est souvent observée dans la succession rapide ou dans le même temps que le laminage. Saisie: Larve s'étend le long de l'axe antéro-postérieur et présente une fréquence élevée de tout le corps en secouant le comportement sans se plier. Voir la vidéo de 7:25. Paralysie: Larve cesse le mouvement. Dans certaines larves de cette est permanente tandis que d'autres présentent alors un mouvement de basse fréquence de pulsation. Voir la vidéo de 7:36. Ces données suggèrent que la température de la goutte d'eau et de la latence d'apparition du char cinqcomportements observés sur ristique réchauffement de la planète de la chute de la larve / eau sont fortement corrélés. Figure 1. Aperçu des étapes expérimentales pour la préparation et le dosage des larves. Avant de doser la nociception avec la sonde thermique ou la chaleur à plaques, les larves provenant d'un stock particulier ou croisement génétique sont récoltés et nettoyés de la nourriture. Si la sensibilisation nociceptive (par opposition à la nociception de base) doit être évaluée, la récolte est suivie par éthérisation (exposition à l'éther), le montage, l'irradiation UV, et une période de récupération sur les denrées alimentaires à la mouche. Larves récoltés ou récupérés sont ensuite soumis à des températures d'essai nocives en utilisant soit la sonde thermique (local) ou la plaque chauffante (global) du test. Les chiffres renvoient aux sections du texte qui décrivent les méthodes de l'étape (s) affichés. Figure 2. Expérimental mis en place pour le dosage de la chaleur à sonde locale. La sonde de chaleur est contrôlée par une unité de commande thermique qui est utilisée pour régler et maintenir la température de la sonde. La sonde est maintenue perpendiculaire à l'axe antéro-postérieur et utilisé pour stimuler la larve à un angle de 45 ° à l'horizontale. Sonde de contact est faite spécifiquement au A4 segment abdominal, comme indiqué. L'utilisateur doit maintenir ce contact avec une légère pression jusqu'à ce que le seuil de 20 secondes ou jusqu'à ce que le comportement de roulement commence. Si la température est perçue comme nuisible, la larve se montrent un comportement de retrait aversif caractérisé par au moins un rouleau 360 °. Le nombre de rouleaux peut être unique ou multiple (voir la figure 4B). Figure 3. Expérimentale mis en place pour le dosage de chaleur à plaques. (A) Caricature d'un point de vue horizontal de la 60 x 15 mm plat de Petri contenant un milieu de 3 èmelarve étoiles à une goutte d'eau ul 80. (B) de dessin animé d'une vue de dessus de la chenille placé au milieu de la goutte d'eau telle que vue à travers le microscope. (C) Photographie d'un point de vue horizontal de la station de travail pour cet essai. (D) Photographie de la larve comme on le voit à travers le microscope. Figure 4. Quantification de la réponse comportementale à l'aide du test sonde thermique. (A) Représentation graphique de la pour cent des répondants appartenant à chaque catégorie (rapide, lente, et les non-répondeurs) fonction de la température. (B) Représentation graphique de la latence à un comportement de retrait par rapport aversif le nombre de rouleaux chaque larve exposées à quatre différentes températures d'essai de nocivité augmente (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, et 52 ° C). Figure 5. Dosage de chaleur à plaques: temps de latence et de la température par rapport à BehAvior. (A) de la latence et la température moyenne goutte d'eau à chaque réponse comportementale dans les conditions optimales de 95 ° C (température de surface de la plaque chaude) et 80 pi d'eau baisse (n = 150). Notez que chaque comportement est observé dans un intervalle de temps particulier. Les températures chutent eau ont été mesurés à l'aide d'un thermocouple inséré dans la partie supérieure ou inférieure de la goutte (n = 10 gouttes pour chaque emplacement) et ces mesures ont été en moyenne. (B) Pourcentage de larves présentant chaque réaction comportementale dans des conditions optimales de dosage. Se débattant, la saisie, et la paralysie sont observées de près de 100% du temps en roulant et le fouet sont observées 77 et 80% du temps, respectivement. À la surface de jeu inférieure saisie des points de température et de la paralysie ne sont pas observées à moins de 200 s et à des points de consigne supérieur de roulement et le fouet peut être ignorée ou peut se produire simultanément. n = 150. (C) Pourcentage de larves qui survivent après l'initiation du comportement paralysie. Les larves ont été chauffés jusqu'à ce que soitla paralysie de l'égrenage et ensuite retiré pour des conditions de culture standard pour récupérer. Mock-traité les larves ont reçu un traitement équivalent, sauf pour l'exposition de la chaleur. Formation des adultes pupes et viable ont été quantifiés les jours 7-13. n = 120. Figure 6. L'inactivation de larves nociceptives des neurones sensoriels augmente les latences de réponse de comportement. Terrain de la latence à chaque comportement pour les génotypes indiqués: w 1118, Gal4 109 (2) 80 = md-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, et md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 expression disques de HES régulés transgènes dans les quatre classes de multidendritic périphériques neurones sensoriels; UAS-Ork1.Δ-C 14 exprime une version modifiée de la drosophile ouverte redresseur canal K + pour la transmission synaptique requis, et U AS-Ork1.Δ-NC 14 exprime en outre une version modifiée de ce même canal qui n'interfère pas avec la transmission synaptique. Notez que seules les larves portant à la fois le driver md-Gal4 6 et les transgènes UAS-Ork1.Δ-C montrent latences accrues pour quatre des cinq comportements observés (thrash, rouleau, à la saisie, et la paralysie). Notez également qu'en raison de la latence accrue au roulement de ces animaux fouet avant qu'ils roulent. Astérisque indique p <0,05 par t de Student-test. n = 30 larves par génotype. Vidéo supplémentaire 1. Cliquez ici pour visionner la vidéo . Vidéo supplémentaire 2. Cliquez ici pour visionner la vidéo . Vidéo supplémentaire 3."Target =" _blank "> Cliquez ici pour visionner la vidéo. Vidéo supplémentaire 4. Cliquez ici pour visionner la vidéo . Vidéo supplémentaire 5. Cliquez ici pour visionner la vidéo . Vidéo supplémentaire 6. Cliquez ici pour visionner la vidéo .