Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em> Drosophila</em> Le larve

Uno schema tipico delle fasi sperimentali per la preparazione di larve normale o UV-sensibilizzata per i due dosaggi nocicezione termica viene mostrato nella Figura 1. 1. Preparazione di larve Larve progenie maschile e femminile di un genotipo desiderato può essere verificata direttamente. In alternativa, un incrocio può essere impostato per ottenere larve progenie di un genotipo definito di interesse. Istituito croci in bottiglie contenenti alimenti volo usando 20-30 femmine vergini e maschi 15-20. 5 giorni dopo uovo giaceva, raccolto e pulito primi larve di terzo stadio scavando il cibo molle fly e delicatamente con acqua corrente tendendo attraverso un 630 micron (diametro dei pori) maglie. Trasferire primi larve terzo stadio (~ 3-4 mm di lunghezza lungo l'asse antero-posteriore) per un piccolo tampone umido di cibo per evitare la fame e essiccazione. In caso di sensibilizzazione nocicettivo è da testare, seguire i passaggi successivi 2.1-2.11. Se le larve devono essere testati in absence di danni ai tessuti, procedere direttamente al punto 3.1. 2. Eterizzazione e l'irradiazione UV Costruire una camera eterizzazione. Tagliare il fondo fuori una provetta 1,5 ml. Con una spatola di metallo caldo sciogliere il bordo tagliato della provetta. Applicare una fitta alla superficie del tubo fuso e lasciar raffreddare. La camera sarà eterizzazione consentire l'ingresso dei fumi di etere, ma evitare la fuga delle larve. Usare pinze o un pennello per posizionare delicatamente 10 larve di terzo stadio precoce all'interno di una fatta in casa camera eterizzazione. Larve posto lungo la parte interna del coperchio e stretta. Nota: I due passaggi devono essere eseguiti in una cappa aspirante come etere è un prodotto chimico potenzialmente esplosivo e suoi vapori possono anestetizzare un umano così come una larva. Posizionare la camera eterizzazione contenente larve all'interno di una vaschetta Coplin contenente un becher da 10 ml portante,batuffolo di cotone imbevuto di ~ 1,5 ml di etere etilico. Avvitare il tappo del vaso Coplin per esporre le larve di fumi etere per 2 a 2,5 minuti. Si noti che i tempi più lunghi eterizzazione può influenzare negativamente il comportamento delle larve o la sopravvivenza. Dopo eterizzazione, rimuovere la camera eterizzazione dal Coplin vaso / bicchiere, dando pochi secondi nella cappa per i fumi etere a dissipare. È ora possibile passare dalla cappa al laboratorio. Utilizzare uno spruzzatore d'acqua per lavare delicatamente larve dalla camera eterizzazione in una piccola scatola di Petri. Utilizzare pinze e un Kimwipe a cancellare le larve anestetizzato secco e delicatamente apporre il lato dorsale su una striscia di nastro biadesivo scotch fissato a 3 slide "x 1" in vetro microscopio. Posizionare il vetrino sulla superficie inferiore di una camera di irradiazione UV ed esporre le larve di luce UV per 6 secondi a 20 mJ / cm 2 intensità. Immergere il vetrino in acqua a galleggiare dolcemente le larve fuori del fronte-retro scotch nastro. Utilizzare pinza o un pennello per posizionare delicatamente le larve irradiato in uno x 15 45 mm Un flacone di coltura di vetro contenente dram ~ 1,0 ml di cibo mosca dove possono recuperare per un periodo di tempo variabile (8 -24 ore) a 25 ° C o altra cultura temperatura desiderata prima di ri-raccolta per le analisi termiche nocicezione. 3. Calore locale sonda per saggi Forniamo uno stimolo nocivo termico per un singolo segmento del corpo larvale utilizzando un custom-built sonda termica prodotto da Pro-Dev Engineering (vedi tabella dei materiali). Sebbene questa sonda ha caratteristiche di progettazione ottimale (una punta metallica di ~ 0,07 millimetri zona 2 e la capacità di mantenere con precisione una temperatura di set point di 23 ° C a 65 ° C) in linea di principio qualsiasi strumento avente una punta che può essere riscaldato ad una temperatura definita per un periodo fino a 20 secondi dovrebbe essere sufficiente. La punta della sonda è usato per stimolare primi 3 ° larve instar proprio sul Dorsalinea mediana a l A4 segmento addominale (vedi Figura 2). In risposta a questo stimolo termico, larve in genere presentano un comportamento avversiva ritiro del materiale lateralmente di 360 gradi o più. Questo comportamento è diverso da loro risposta al tocco di luce ad una non-nocivo sonda di metallo temperatura ambiente che comporta in genere una breve pausa nella loro attività locomotoria 13. Protocollo per il saggio della sonda di calore: Pre-set temperatura della sonda termica desiderata set point. Utilizzare un pennello o pinze per trasferire delicatamente una larva individuo su una pedana piatta (che di solito uso un piccolo pezzo di taglio vinile da un legante) su cui le larve sarà successivamente stimolato. La larva deve essere coperta da una pellicola sottile di acqua prima del contatto con la sonda termica. Il film di acqua che copre la larva dovrebbe essere il meno possibile e coprire completamente la larva, garantendo nel contempo che la larva non è asciutta quando si tocca il vinile. Premere delicatamente la punta della sonda contro la larva a A4 segmento esercitando una leggera pressione con la punta di circa 45 ° tra la sonda e la superficie di larva (vedi Figura 2). La pressione dovrebbe causare una leggera rientranza sulla superficie del larva e sarà solitamente sufficiente per evitare locomozione. Se la larva continua a muoversi, esercitare una pressione un po 'di più e di solito si ferma. Non registrare dati da larve che si muovono al di là del campo visivo o per i quali il contatto della sonda costante non possono essere raggiunti fino risposta o un taglio del 20 s. Continuare a stimolare la larva fino a quando una risposta viene esposto o ritiro fino al 20 cutoff secondi si raggiunge, a seconda che si verifica prima. Rispondendo larve tipicamente prime mostrano un comportamento preliminare di sollevamento della testa e la coda. Questo è generalmente seguita dal comportamento ritiro di laminazione di almeno 360 gradi. Solo un rotolo completo di 360 gradi è stato segnato come un comportamento nocifensive (il HEA preliminared o il rilancio di coda non lo è). Una volta che il comportamento di ritiro è avviato contatti con la sonda di rilascio e registrare il tempo di latenza o di recesso. Se non si osserva il comportamento di ritiro entro 20 secondi, quindi la larva è un non-responder. I responder possono essere ulteriormente suddivise in categorie 2. Se il comportamento di ritiro è indicato entro 5 secondi, poi la larva è un fast-responder. Se il comportamento di ritiro è indicato tra i 5-20 secondi, poi la larva è una slow-responder (vedi figura 1 Babcock, et al. 2009) 1. 4. Globale di calore Assay Piastra Il saggio di calore a piastre è stato progettato per misurare la nocicezione termica in larve Drosophila quando l'animale intero è di fronte a uno stimolo nocivo termico. Individuale a metà 3 ° larve instar vengono inseriti in un calo 80 microlitri di acqua su un piatto di 15 x 60 millimetri Petri – vedi figura 3 per schema e le foto del set di testup. Il piatto Petri viene poi posto su una piastra riscaldante solido (denominato "piatto caldo"). Quando la temperatura aumenta di goccia dell'acqua, la larva presenta una serie di cinque comportamenti stereotipati che abbiamo chiamato thrash testa, rotolo, frusta, convulsioni e paralisi. Dal momento che questi comportamenti sono in qualche misura una funzione della temperatura setpoint della piastra calore e il volume d'acqua in cui la larva si immerge qui presentiamo quello che abbiamo trovato per essere le condizioni ottimali (95 ° C di calore piatto, goccia 80 microlitri di acqua) per osservare tutti e 5 i comportamenti, con sovrapposizione minima tra di loro. Protocollo per l'analisi di calore a piastre: Posizionare le guide illuminazione a fibre ottiche per garantire che vi sia una sufficiente illuminazione ad alto contrasto per la visualizzazione della larva. Utilizzare una larva di test se necessario. La potenza dovrebbe essere accesa basso per evitare il calore ambiente sulla larva da testare. Posizionare il blocco di riscaldamento nella piastra di calore con superficie piana e posizionare la piastra di calore sullail microscopio base. Accendere il calore a piastre in posizione "alta", consentono circa 15 minuti per stabilizzare la temperatura, e regolare di conseguenza per ottenere una temperatura superficiale di 95 ° C. Misurare 80 pl di acqua distillata e collocare la goccia d'acqua nel mezzo del x 60 15 mm in polistirene capsula Petri con una micropipetta. Utilizzare pinze ad appoggiarlo pulito metà 3 ° larva stadio al centro della goccia d'acqua. Prova a trasferire la larva con il volume minimo possibile di acqua in modo che la goccia da riscaldare rimane il più vicino possibile a quello originale 80 microlitri. Delicatamente porre la capsula Petri contenente la goccia d'acqua e la larva sul blocco riscaldante solido sulla piastra di calore. Regolare rapidamente la posizione del piatto in modo che il larva intera goccia d'acqua in vista. Vedere Figura 3 e video 1-6. Avviare il timer al momento della piastra di Petri è posto sul blocco riscaldante solido della piastra termica e registrareil tempo di inizio di ciascun comportamento. Se lo si desidera, i comportamenti possono anche essere video registrato – Guarda i video 1-5 per gli esempi rappresentativi di ogni comportamento. Leica software versione 3.7 è stato utilizzato per la registrazione dei filmati, modalità di registrazione è stato "Continuous", fotocamera a risoluzione 3 Megapixel era (noi abbiamo usato 0.63x zoom con il quale la risoluzione dell'immagine calcolata è di 10 micron / pixel) e frames al secondo sono stati 44,5. 5. Risultati rappresentativi Calore locale sonda per saggi di: A contatto con la sonda termica, una larva mostra tipicamente un comportamento preliminare di sollevare la testa e la coda. Tipicamente il sollevamento della testa è visto prima, seguita dal sollevamento della coda. Pochi secondi dopo questo comportamento preliminare la larva di solito inizia a rotazione laterale a cui ci riferiamo come "il comportamento di ritiro avversione". Il tempo dopo il quale viene mostrato il comportamento preliminare o il comportamento di recesso può variare da temperatura o gesfondo elettromagnetica. Nel nostro studio iniziale abbiamo misurato la percentuale di larve che presentano un ritiro avversione a temperature diverse sonde set point e ha scoperto che 48 ° C era la temperatura minima alla quale hanno risposto tutte le larve veloce (<5 s). Qui, si segnala che c'è un massimale per la risposta delle larve nocicezione termica (Figura 4A). 100 responder sulla veloci sono osservati fino a una sonda di temperatura di 52 ° C. Tuttavia, a 54 ° C e superiori, 90% o più delle larve riescono a rispondere anche dopo 20 s di contatto. Queste larve non continuare a muoversi dopo l'20 s cutoff. Come notato in precedenza 1, le categorie di comportamento di ritiro a ciascuna delle temperature può essere tracciata e confrontati statisticamente. Dato che questo è un test comportamentale vi è una certa variabilità da larva di larva e tra i singoli utenti. Per tenere conto di questo si misurano solitamente 3 serie di 30 larve per condizione di test. Oltre alla semplice classificazione di wilatenza thdrawal che abbiamo riportato in precedenza, si segnala qui che l'ampiezza (numero di rotoli o il tempo trascorso nel comportamento di ritiro repulsivo) può anche essere misurata (vedi Figura 4). Sorprendentemente, sembra esserci una relazione inversa tra la temperatura di ingresso e la robustezza della risposta in quanto temperature inferiori sembra provocare un maggior numero di rotoli (Figura 4B) e più tempo trascorso in sospensione avversivi (dati non mostrati). Questo può indicare che la durata di esposizione ad una temperatura nociva potrebbe essere la principale determinante di robustezza. Di calore a piastre del saggio: Cinque comportamenti stereotipati locomotore sono stati osservati al momento del trasferimento della larva immersa in acqua per il calore a piastre. Questi sono descritti di seguito e mostrato nel video insieme con il comportamento tipico locomotoria di una larva riscaldata in acqua. Le latenze medie a cui vengono osservate tali comportamenti sono mostrati nella Figura 5A, in quanto sono le temperature medie goccia d'acqua misurate per ciascun latenza. Nelle condizioni ottimali di saggio qui presentata la percentuale di larve che presentano ciascuno un comportamento diverso variava dal 77-100% (figura 5B) sebbene occasionalmente i comportamenti di laminazione e montare sono omessi, sovrapposizione, o si verificano in ordine inverso. I comportamenti osservati, in ordine cronologico, sono descritti come segue e può essere visto nel video secondo gli orari indicati di seguito: Movimento normale in assenza di calore: locomozione peristaltica accompagnata dalla ricerca i movimenti della testa. Guarda il video dalle 6:27. Thrash Testa: Larva testa si muove velocemente in un movimento in avanti o laterale. Questo movimento è simile alla loro normale locomozione in acqua (vedi video 1), ma si verifica più a scatti e persistente. Guarda il video da 6:40. Roll: Larva scorre lateralmente di almeno di 360 °. Guarda il video da 6:50. Ciò può avvenireun numero variabile di volte e talvolta comporta rotoli incompleti. Ai fini del punteggio il comportamento che conta solo pieni rotoli a 360 gradi. Questo comportamento è il più simile a quella osservata con l'applicazione locale della sonda calore. Whip: Larva mostre rapida contrazione-rilascio movimenti lungo l'asse antero-posteriore che portano la testa molto brevemente vicino alla coda. Guarda il video da 7:11. Frustare è spesso osservato in rapida successione o contemporaneamente a rotolamento. Convulsioni: Larva si estende lungo l'asse antero-posteriore e presenta una alta frequenza di tutto il corpo un comportamento scuotendo senza piegarsi. Guarda il video da 7:25. Paralisi: Larva cessa il movimento. In alcune larve questo è permanente, mentre altri quindi presentano una bassa frequenza di pulsazione movimento. Guarda il video da 7:36. Questi dati suggeriscono che la temperatura della goccia d'acqua e la latenza di insorgenza delle cinque chargone comportamenti osservati in seguito a riscaldamento globale della larva / goccia d'acqua sono altamente correlati. Figura 1. Schema di fasi sperimentali per la preparazione e il dosaggio delle larve. Prima di essere analizzati nocicezione con la sonda di calore o di calore a piastre, larve derivata da una particolare azione o incrocio genetico sono stati raccolti e puliti di cibo. In caso di sensibilizzazione nocicettiva (al contrario di nocicezione basale) è da valutare, la raccolta è seguita da eterizzazione (esposizione a etere), montaggio, radiazioni UV, e un periodo di recupero sul cibo fly. Larve raccolte o recuperati vengono poi sottoposti a temperature di prova nocive utilizzando sia la sonda di calore (locale) o la piastra di calore (globale) del test. I numeri si riferiscono alle sezioni del testo metodi che descrivono il passo (s) indicato. Figure 2. Sperimentale istituito per il dosaggio locale sonda termica. La sonda di calore è controllato da un'unità di controllo termico che viene utilizzato per impostare e mantenere la temperatura della sonda. La sonda è tenuto perpendicolare all'asse antero-posteriore e usati per stimolare la larva ad un angolo di 45 ° rispetto all'orizzontale. Contatto Probe è stato creato specificamente al segmento addominale A4, come indicato. L'utente deve mantenere questo contatto con una leggera pressione fino al cutoff 20 secondi o fino a quando il comportamento di rotolamento ha inizio. Se la temperatura viene percepita come nocive, la larva mostrerà un comportamento avversiva ritiro caratterizzato da almeno un rotolo di 360 °. Il numero di rulli può essere singola o multipla (vedere Figura 4B). Figura 3. Set-up sperimentale per il saggio di calore a piastre. (A) Cartoon di una visione orizzontale della 15 x 60 millimetri capsula Petri contenente una metà del 3 ° inlarva stelle in una goccia d'acqua di 80 microlitri. (B) Cartoon di una vista dall'alto della larva posto al centro della goccia d'acqua, come visto attraverso il microscopio. (C) Fotografia di una visione orizzontale della workstation per questo dosaggio. (D) Fotografia di larva, come visto attraverso il microscopio. Figura 4. Quantificazione di risposta comportamentale per mezzo del test sonda termica. (A) Plot della percentuale di responder appartenenti a ciascuna categoria (rapida, lenta, e non-responders) in funzione della temperatura. (B) Plot della latenza di ritiro comportamento repulsivo rispetto al numero di rotoli ciascuna larva esposto a quattro diverse temperature di prova di nocività crescente (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, e 52 ° C). Figura 5. Saggio di calore a piastre: latenza e le temperature in funzione BehAvior. (A) Latenza e temperatura media goccia a ciascuna risposta comportamentale nelle condizioni ottimali di 95 ° C (temperatura di superficie della piastra calda) e 80 pl di goccia acqua (n = 150). Si noti che ogni comportamento è stato osservato in un particolare intervallo di tempo. Temperature goccia d'acqua sono stati misurati utilizzando una termocoppia inserita nella parte superiore o inferiore della goccia (n = 10 gocce per ogni posizione) e queste misure sono state in media. (B) Percentuale di larve che presentano ogni risposta comportamentale in condizioni di saggio ottimali. Botte, grippaggio, e paralisi si osservano quasi il 100% del tempo durante il rotolamento e montare sono osservate 77 e il 80% del tempo, rispettivamente. A bassa temperatura superficiale set sequestro punti e paralisi non sono stati osservati entro 200 s e al set point superiori al rotolamento e da montare può essere saltato o può avvenire simultaneamente. n = 150. (C) Percentuale di larve che sopravvivono dopo l'inizio del comportamento paralisi. Le larve sono state riscaldate fino essereparalisi sgranatura e poi rimosso per condizioni di coltura standard per recuperare. Mock-trattato larve ricevuto un trattamento equivalente, fatta eccezione per l'esposizione al calore. Formazione degli adulti pupe e vitali sono stati quantificati i giorni 7-13. n = 120. Figura 6. Inattivazione del larvali neuroni sensoriali nocicettivi aumenta latenze di risposta comportamentali. Plot della latenza di ogni comportamento per i genotipi indicati: w 1118, Gal4 109 (2) 80 = md-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, e md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 espressione di unità di UAS-regolamentati transgeni in tutte e quattro le classi di multidendritic neuroni periferici sensoriali; UAS-Ork1.Δ-C 14 esprime una versione modificata del metodo aperto di Drosophila raddrizzatore K + canale necessaria per la trasmissione sinaptica, e U AS-Ork1.Δ-NC 14 esprime un'ulteriore versione modificata di questo stesso canale che non interferisce con la trasmissione sinaptica. Si noti che le larve solo quelle che riportano sia l'md-Gal4 conducente 6 e le UAS-Ork1.Δ-C transgeni mostrano latenze aumentate per quattro dei cinque comportamenti osservati (thrash, roll, convulsioni e paralisi). Si noti inoltre che a causa della latenza aumentata a rotolare questi frusta gli animali prima del lancio. Asterisk denota p <0.05 da Student t-test. n = 30 larve per genotipo. Video supplementare 1. Clicca qui per guardare il video . Video supplementare 2. Clicca qui per guardare il video . Supplemental Video 3."Target =" _blank "> Clicca qui per guardare il video. Video supplementare 4. Clicca qui per guardare il video . Video supplementare 5. Clicca qui per guardare il video . Video supplementare 6. Clicca qui per guardare il video .