Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in<em> Drosophila</em> Larven

Een typische omtrek van de experimentele procedure voor bereiden normale of UV-gevoelige larven van de twee thermische nociceptie assays is weergegeven in figuur 1. 1. Voorbereiding van Larven Mannelijke en vrouwelijke nakomelingen larven van een gewenste genotype kan direct worden getest. Als alternatief kan een genetische kruis worden ingesteld om nageslacht larven van een bepaalde genotype van belang te verkrijgen. Stel kruisen in flessen die vlieg voedsel met behulp van 20-30 maagdelijke vrouwtjes en 15-20 mannen. 5 dagen na ei te leggen, de oogst en schone begin van de derde instar larven door scheppen uit het slappe vlieg voedsel en voorzichtig belasten met stromend water door middel van een 630 micrometer (poriëngrootte) mesh. Breng het begin van de derde instar larven (~ 3-4 mm in de lengte langs de achterwaartse as) naar een klein vochtig pad van voedsel aan honger en uitdroging te voorkomen. Als nociceptieve sensibilisatie getest moet worden, volgt u de volgende stappen 2,1 tot 2,11. Als larven moeten worden getest in de absence van weefselbeschadiging, direct doorgaan naar stap 3.1. 2. Verdoving en UV-bestraling Construeer een verdoving kamer. Snij de bodem uit een 1,5 ml microcentrifugebuis. Met een hete metalen spatel smelten van de snijkant van de microcentrifugebuis. Aanbrengen van een fijn gaas aan de gesmolten buisoppervlak en laat afkoelen. De verdoving kamer zullen toelaten van de ether dampen maar te voorkomen dat de larven ontsnappen. Gebruik een tang of een kwast om voorzichtig te plaatsen 10 begin van de derde instar larven in een zelfgemaakte verdoving kamer. Plaats larven langs de binnenzijde van het deksel en afsluiten. Let op: De volgende twee stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast zoals ether is een potentieel explosieve chemische en de dampen kunnen verdoven een mens en een larve. Plaats de verdoving kamer met daarin larven in een Coplin pot met daarin een 10 ml bekerglas het dragen van eenwatje gedrenkt ~ 1,5 ml diethylether. Schroef de dop van de Coplin pot om de larven bloot te stellen aan ether rook voor 2 tot 2,5 minuten. Merk op dat langere verdoving keer negatief kan larvale gedrag of overleving beïnvloeden. Na de verdoving, verwijder de verdoving kamer van de Coplin pot / beker, het geven van een paar seconden in de kap voor de ether rook te verdrijven. U kunt nu terug te gaan van de kap naar het lab. Gebruik een water spuit fles om voorzichtig larven spoelen van de verdoving kamer in een kleine petrischaal. Gebruik een tang en een Kimwipe te wissen onder narcose larven droog en zacht brengen ze dorsale kant naar boven op een strook dubbelzijdig plakband bevestigd aan een 3 "x 1" glas microscoopglaasje. Plaats de schuif op de bodem van een UV bestraling kamer wordt blootgesteld larven UV licht gedurende 6 seconden bij 20 mJ / cm 2 intensiteit. Dompel de glijbaan in het water zachtjes drijven de larven off van de dubbelzijdige scotch tape. Gebruik een tang of een penseel op de bestraalde larven voorzichtig te plaatsen in een 15 x 45 mm een ​​dram glazen cultuur flacon met ~ 1,0 ml van de vlieg voedsel waar ze kunnen voor een variabele periode (8 -24 uur) terug bij 25 ° C of andere gewenste cultuur temperatuur alvorens opnieuw te oogsten voor thermische nociceptie assays. 3. Lokale warmte Probe Assay Wij leveren een schadelijke thermische stimulans voor een individuele larvale lichaam segment met behulp van een custom-built thermische sonde vervaardigd door Pro-Dev Engineering (zie tabel van materialen). Hoewel deze probe is optimaal ontwerp kenmerken (een metalen punt van 0,07 mm ~ 2 gebied en het vermogen om nauwkeurig te handhaven een ingestelde temperatuur van 23 ° C tot 65 ° C) in principe een gereedschap met een uiteinde dat kan worden verwarmd een bepaalde temperatuur gedurende een periode van 20 seconden volstaan. De sonde wordt gebruikt voor het begin van de 3 e instar larven precies te stimuleren over de dorsal middellijn van de buik-segment A4 (zie figuur 2). In antwoord op deze thermische stimulus, zal larven vertonen in het algemeen een aversieve terugtrekking gedrag van het rollend zijdelings door de 360 ​​graden of meer. Dit gedrag is verschillend van de lichte aanraking reactie op een onschadelijk kamertemperatuur metalen sonde die in het algemeen omvat een korte pauze in de motorische activiteit 13. Protocol voor de warmte-probe-test: Ingestelde temperatuur van de thermische sonde gewenst instelpunt. Gebruik een kwast of een tang om een ​​individuele larve zachtjes over te dragen op een vlak platform (we meestal gebruik van een klein stukje vinyl gesneden uit een bindmiddel) waarop de larven vervolgens zal worden gestimuleerd. De larve moet worden bedekt met een dunne film van water voor het contact met de thermische sonde. De film van het water voor de larve moet zo weinig mogelijk en volledig bedekken de larve, met dien verstande dat de larve niet droog is bij het aanraken van het vinyl. Druk de tip van de sonde tegen de larve op segment A4 lichte druk met de punt op ongeveer een hoek van 45 ° tussen de sonde en het oppervlak van de larve (zie figuur 2). De druk dient tot een kleine inkeping op het oppervlak van de larven en zal gewoonlijk voldoende beweging te voorkomen. Als de larve blijft bewegen, toe te passen iets meer druk en het zal meestal stoppen. Niet opnemen van gegevens van larven die verder gaan dan het gezichtsveld of waarvoor een constante probe contact niet kan worden bereikt tot effect of de 20 s cutoff. Ga door het stimuleren van de larve tot een terugtrekking reactie wordt tentoongesteld of tot de 20 seconden cutoff is bereikt, hetgeen het eerste plaatsvindt. Reageren larven meestal eerst laten zien een voorlopige gedrag van het optillen van de kop en de staart. Dit wordt meestal gevolgd door de terugtrekking gedrag van het rollend op zijn minst 360 graden. Alleen een volledige roll van 360 graden wordt gescoord als nocifensive gedrag (de voorlopige head of staart raise is niet). Na de terugtrekking gedrag wordt gestart vrijlating contact met de sonde en noteer de latency of tijd om terugtrekking. Als er geen terugtrekking gedrag wordt waargenomen binnen 20 seconden, dan is de larve is een niet-responder. De responders kan verder worden onderverdeeld in 2 categorieën. Als de terugtrekking gedrag wordt binnen 5 seconden, dan is de larve is een snel responder. Als de terugtrekking gedrag wordt getoond 5-20 seconden, waarna de larve is een langzaam-responder (zie figuur 1 in Babcock, et al.. 2009) 1. 4. Global Warmte Plate Assay De warmte plaat test werd ontworpen om thermische nociceptie meten in Drosophila larven als de hele dier wordt geconfronteerd met een schadelijke thermische stimulus. Individuele midden van de 3 e instar larven worden geplaatst in een 80 ul druppel water op een 60 x 15 mm petrischaal – zie figuur 3 voor schema's en foto's van de test setop. De Petri-schaal wordt vervolgens op een vaste verwarmingsblok (aangeduid als "heat plaat"). Naarmate de temperatuur van het water druppel stijgt, de larve vertoont een serie van vijf stereotype gedragingen we hebben genoemd hoofd thrash, roll, zweep, beslaglegging, en verlamming. Omdat dit gedrag tot op zekere hoogte een functie van de gewenste temperatuur van de warmte plaat en de hoeveelheid water, waarin de larve wordt ondergedompeld presenteren we hier wat we hebben gevonden zijn de optimale omstandigheden (95 ° C hitte plaat, 80 ul druppel water) voor het waarnemen alle 5 de minimale gedrag overlap tussen hen. Protocol voor warmte-plaat test: Plaats de glasvezel lichtgeleiders om ervoor te zorgen dat er voldoende hoog contrast verlichting voor het bekijken van de larve. Gebruik een test larve indien nodig. De lichtsterkte moet op laag omgevingswarmte op de larve te testen te voorkomen. Zet de verwarming blok in de warmte plaat met een plat oppervlak en plaats de warmte plaat opde microscoop base. Zet het vuur plaat om de "hoge" positie, laat ongeveer 15 minuten om de temperatuur te stabiliseren en te passen om een ​​oppervlakte temperatuur van 95 ° C te bereiken Meet 80 pl van gedestilleerd water en plaats de waterdruppel in het midden van de 60 x 15 mm polystyreen petrischaal met een micropipettor. Gebruik een tang om een schone midden van de 3 e instar larve voorzichtig te plaatsen in het midden van de waterdruppel. Proberen de larven zodat overdragen met minimale mogelijke hoeveelheid water die de druppel te verwarmen blijft zo dicht mogelijk bij de oorspronkelijke 80 pi. Plaats voorzichtig de petrischaal met water druppel en de larve op de vaste verwarming blok op het vuur plaat. Snel aan te passen de locatie van de schotel, zodat de hele larve en drop van het water in het zicht staan. Zie figuur 3 en video's 1-6. Start de timer op het moment dat de Petri-schaal wordt geplaatst op de vaste verwarmingsblok van de warmte plaat en opnementijdstip van aanvang van elke gedrag. Desgewenst kan het gedrag ook video opgenomen – zie video 1-5 voor representatieve voorbeelden van elk gedrag. Leica-software versie 3.7 werd gebruikt voor het opnemen van de films, opnamemodus was "Continuous", camera resolutie is 3 Megapixels (wij gebruikten 0.63x zoom, waarmee de berekende beeldresolutie is 10 micrometer / pixel) en frames / seconde waren 44,5. 5. Representatieve resultaten Probe Assay lokale warmte: Bij contact met de thermische sonde, een larve vertoont meestal een voorlopige gedrag van de intrekking van haar kop en staart. Typisch de opheffing van het hoofd wordt gezien eerst gevolgd door het opheffen van de staart. Een paar seconden na deze inleidende het gedrag van de rups start meestal zijdelings rollen die we aanduiden als de "aversieve terugtrekking gedrag." De tijd waarna de voorlopige gedrag of de terugtrekking gedrag wordt getoond kan variëren door temperatuur of gesche achtergrond. In onze eerste studie meten we het percentage van de larven vertonen aversieve terugtrekking op verschillende sonde ingestelde temperaturen en vond dat 48 ° C was de laagste temperatuur waarbij alle larven reageerde snel (<5 s). Hier wordt beschreven dat er een maximum voor de larven thermische nociceptie reactie (Figuur 4A). 100% snelle responders waargenomen tot een kerntemperatuur van 52 ° C. Echter, bij 54 ° C en hoger, 90% of meer van de larven niet zelfs na 20 s contact reageren. Deze larven niet verder te gaan na de 20 s cutoff. Zoals eerder opgemerkt 1 kan de categorieën terugtrekkingsgedrag bij elke temperatuur worden uitgezet en statistisch vergeleken. Gezien het feit dat dit een gedrags-test is er enige variabiliteit van de larve, rups en tussen individuele gebruikers. Om rekening te houden wij meting doorgaans 3 sets van 30 larven per test staat. Naast de eenvoudige indeling van withdrawal latency die we eerder hebben gemeld, melden wij hier dat de amplitude (het aantal rollen of de tijd doorgebracht in aversieve terugtrekking gedrag) kan ook worden gemeten (zie figuur 4). Verrassenderwijs blijkt er een inverse tussen de aanvoertemperatuur en de robuustheid van de reactie omdat lagere temperaturen blijkt een groter aantal rollen veroorzaken (Figuur 4B) en meer tijd in aversieve terugtrekking (gegevens niet getoond). Dit kan erop wijzen dat de duur van de blootstelling aan een schadelijke temperatuur kan de belangrijkste determinant van robuustheid zijn. Hitteplaat Assay: Vijf stereotype motorische gedragingen in acht worden genomen bij de overdracht van de larve ondergedompeld in water om de warmte plaat. Deze worden hierna beschreven en getoond in de video met het typische gedrag van een motorisch verwarmde larve in water. De gemiddelde latencies waarbij deze gedrag waargenomen wordt in figuur 5A, de gemiddelde druppel water temperatuur gemeten voor elke wachttijd. Onder de optimale testomstandigheden die hier het percentage van de larven met elk afzonderlijk gedrag varieerde 77 tot 100% (figuur 5B), maar zo nu en dan de rollen en opzwepende gedrag worden weggelaten, overlappen of zich in omgekeerde volgorde. De waargenomen gedrag, in chronologische volgorde, als volgt worden beschreven en kan worden bekeken in de video op de aangegeven tijden hieronder: De normale beweging in afwezigheid van warmte: peristaltische beweging vergezeld door te zoeken op hoofdbewegingen. Zie Video van 6:27. Hoofd Thrash: Larve beweegt het hoofd al snel in een voorwaartse of zijdelingse beweging. Deze motie is vergelijkbaar met hun normale beweging in het water (zie video 1), maar komt steeds schokkerig en aanhoudend. Zie Video van 6:40. Rol: Larve rolt zijdelings op zijn minst een volledige 360 °. Zie Video van 6:50. Dit kan gebeureneen variabel aantal keer en soms gaat onvolledige rollen. Voor de toepassing van het scoren van de gedrag dat we alleen rekenen volledige 360 ​​° rollen. Dit gedrag is het meest vergelijkbaar met die waargenomen bij lokale toepassing van de warmte sonde. Whip: Larve vertoont een snelle krimp-release bewegingen langs de achterwaartse as die het hoofd te brengen heel kort in de buurt van de staart. Zie Video van 7:11. Whipping wordt vaak waargenomen in snelle opeenvolging of tegelijkertijd als rollen. Inbeslagneming: Larve strekt zich uit langs de achterwaartse as en vertoont een hoge frequentie van het gehele lichaam schudden gedrag zonder te buigen. Zie Video van 7:25. Verlamming: Larve ophoudt beweging. In een aantal larven is dit permanent terwijl andere dan vertonen een lage frequentie pulsatie beweging. Zie Video van 7:36. Deze gegevens suggereren dat de temperatuur van het water druppel en de latency tot aan het begin van de vijf chardie kenmerkend gedrag waargenomen op de wereldwijde opwarming van de larve / water druppel zijn sterk gecorreleerd. Figuur 1. Overzicht van experimentele stappen voor de voorbereiding en kwantitatieve analyse van larven. Voorafgaand aan het testen van nociceptie met de hitte sonde of de warmte plaat, zijn larven afkomstig van een bepaald aandeel of genetische kruis geoogst en ontdaan van voedsel. Als nociceptieve sensibilisatie (in tegenstelling tot de uitgangswaarde nociceptie) moet worden beoordeeld, wordt de oogst gevolgd door verdoving (blootstelling aan ether), montage, UV-straling, en een periode van herstel op de vlieg voedsel. Geoogst of hersteld larven worden vervolgens onderworpen aan schadelijke testtemperaturen met behulp van de warmte sonde (lokaal) of de warmte plaat (globaal) test. Getallen verwijzen naar delen van de volgende tekst dat de stap (s) weergegeven beschrijven. Figure 2. Experimentele opgezet voor lokale warmte probe assay. De warmte probe wordt door een thermische besturingseenheid die wordt gebruikt om en de temperatuur van de sonde. De sonde wordt loodrecht gehouden de achterwaartse as en gebruikt om de larven stimuleren een hoek van 45 ° met de horizontaal. Probe contact is speciaal gemaakt op de buik segment A4, zoals afgebeeld. De gebruiker moet ervoor zorgen dat dit contact met lichte druk tot aan de 20 seconden cutoff of tot het rollend gedrag begint. Als de temperatuur wordt ervaren als schadelijk wordt de larven tonen een onaangename terugtrekkingsgedrag gekenmerkt door ten minste een rol 360 °. Het aantal rollen kunnen een of meerdere (zie figuur 4B). Figuur 3. Experimentele set-up voor warmte plaat test. (A) Cartoon een horizontaal aanzicht van de 60 x 15 mm Petri schaal die een half 3e inster larve in een 80 ul waterdruppel. (B) Cartoon een bovenaanzicht van de larven in het midden van de waterdruppel zoals weergegeven door de microscoop. (C) Foto van een horizontaal aanzicht van het werkstation voor deze test. (D) Foto van de larven zoals gezien door de microscoop. Figuur 4. Kwantificering van gedrags-reactie met behulp van de warmte probe assay. (A) Plot van het percentage van de respondenten die behoren tot elke categorie (snel, langzaam, en non-responders) versus temperatuur. (B) Grondstuk de latentie aversieve terugtrekkingsgedrag versus het aantal rollen elke larve gerealiseerd op vier verschillende beproevingstemperatuur van toenemende schadelijkheid (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C en 52 ° C). Figuur 5. Warmte plaat test: latentie en temperatuur vs BehAvior. (A) Latentie en gemiddelde waterdruppel temperatuur elk gedragsrespons onder optimale omstandigheden van 95 ° C (verwarmingsplaat temperatuur) en 80 pi druppel water (n = 150). Merk op dat elke gedrag waargenomen binnen een bepaald tijdsinterval. Water drop temperaturen werden gemeten met een thermokoppel aangebracht in de boven-of onderzijde van de druppel (n = 10 druppels per locatie) en deze metingen werden gemiddeld. (B) Percentage van larven vertonen elk gedrags-respons onder optimale testomstandigheden. Thrashing, grijpen, verlamming waargenomen bijna 100% van de tijd tijdens het rijden en opklopeigenschappen waargenomen 77 en 80% van de tijd, respectievelijk. Bij lagere temperatuur setpunten inbeslagneming en de verlamming niet worden nageleefd binnen 200 s en bij hogere instelpunten rollen en zweepslagen kunnen worden overgeslagen of kan gelijktijdig plaatsvinden. n = 150. (C) Percentage van de larven die na het opstarten van de verlamming gedrag te overleven. Larven werden verhit tot zijnegreneren verlamming en vervolgens verwijderd van standaard kweekomstandigheden te herstellen. Mock-behandelde larven ontvangen gelijkwaardige behandeling, behalve voor blootstelling aan hitte. Vorming van poppen en levensvatbare volwassenen werden gekwantificeerd op dagen 7-13. n = 120. Figuur 6. Inactivatie van larvale nociceptieve sensorische neuronen verhoogt gedragsmatige reactie latency. Perceel van de latentie aan elk gedrag voor de aangegeven genotypes: w 1118, Gal4 109 (2) 80 = md-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C en md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 drives uitdrukking van UAS-gereguleerde transgenen in alle vier de klassen van multidendritic perifere sensorische neuronen, UAS-Ork1.Δ-C 14 drukt een aangepaste versie van de Drosophila geopend gelijkrichter K + kanaal die nodig zijn voor synaptische transmissie, en U AS-Ork1.Δ-NC 14 drukt een verdere aangepaste versie van deze zelfde kanaal dat niet interfereert met synaptische transmissie. Merk op dat alleen larven met zowel de MD-Gal4 driver 6 en de UAS-Ork1.Δ-C transgenen tonen verhoogde latency voor vier van de vijf geobserveerde gedrag (thrash, roll, beslag, en verlamming). Merk ook op dat als gevolg van de toegenomen wachttijd aan het rollend deze dieren zweep voordat zij rollen. Asterisk geeft p <0,05 door de Student's t-test. n = 30 larven per genotype. Aanvullende Video 1. Klik hier om video te bekijken . Aanvullende Video 2. Klik hier om video te bekijken . Aanvullende Video 3."Target =" _blank "> Klik hier om video te bekijken. Aanvullende Video 4. Klik hier om video te bekijken . Aanvullende Video 5. Klik hier om video te bekijken . Aanvullende Video 6. Klik hier om video te bekijken .