Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em> Drosophila</em> Larven

Eine typische Kontur der experimentellen Schritte zur Herstellung normalen oder UV-sensibilisierten Larven für die beiden thermischen Nozizeption Assays ist in 1 gezeigt. 1. Herstellung von Larven Männlichen und weiblichen Nachkommen Larven eines gewünschten Genotyp direkt getestet werden. Alternativ kann auch eine genetische Kreuz eingerichtet werden, um Nachkommenschaft Larven eines definierten Genotyp von Interesse zu erhalten. Richten Sie Kreuze in Flaschen mit Fliege Lebensmitteln mit 20-30 und 15-20 jungfräulichen Weibchen Männchen. 5 Tage nach dem Ei zu legen, ernten und sauber frühen dritten Larvenstadium durch Aushöhlungen die breiige Nahrung und Fliege sanft belasten mit fließendem Wasser durch ein 630 um (Porengröße) Maschen. Übertragen der frühen dritten Larvenstadium (~ 3-4 mm in der Länge entlang der anteroposterioren Achse) zu einem kleinen feuchte Auflage von Lebensmitteln, um Hunger und Austrocknung zu vermeiden. Wenn nozizeptive Sensibilisierung soll getestet werden, befolgen Sie die nachfolgenden Schritte 2,1-2,11. Wenn Larven werden in der absenc getestet werdene von Gewebeschäden, gehen Sie direkt zu Schritt 3.1. 2. Ätherisation und UV-Bestrahlung Konstruieren Sie ein Ätherisation Kammer. Schneiden Sie den Boden aus einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit einem heißen Metallspatel schmelzen die Schnittkante der Mikrozentrifugenröhrchen. Bringen Sie ein feines Netz, um das geschmolzene Rohroberfläche und abkühlen lassen. Die Kammer wird es Ätherisation Eintrag von Ätherdämpfe aber verhindern Larven Flucht. Verwenden einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig Platz 10 frühen dritten Larvenstadium in einer hausgemachten Ätherisation Kammer. Larven Platz entlang der Innenseite des Deckels und schließen. Hinweis: Die nächsten beiden Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, wie Äther eine explosionsfähige Chemikalien ist und seine Dämpfe können einen Menschen ebenso wie eine Larve zu betäuben. Setzen Sie den Ätherisation Kammer mit Larven in eine Glasküvette mit einem 10-ml-Becher trägt einWattebausch mit ~ 1,5 ml Diethylether getränkt. Schrauben Sie die Kappe des Coplin, um die Larven zu entlarven Ätherdämpfe für 2 bis 2,5 Minuten. Beachten Sie, dass mehr Ätherisation Zeiten können sich negativ auf Verhalten der Larven oder Überleben. Nach Ätherisation, entfernen Sie die Ätherisation Kammer aus dem Coplin / Becher, so dass Sie ein paar Sekunden in der Motorhaube für Ätherdämpfe zu zerstreuen. Sie können nun von der Motorhaube wieder zurück ins Labor. Verwenden Sie eine Wasser Spritzflasche vorsichtig abspülen Larven aus dem Ätherisation Kammer in eine kleine Petrischale. Verwenden Sie eine Pinzette und Kimwipe auszulöschen narkotisierten Larven sanft trocken und bringen sie dorsal bis auf einen Streifen doppelseitiges Klebeband befestigt an einem 3 "x 1" Glas-Objektträger. Den Objektträger auf der Bodenfläche eines UV-Bestrahlung ausgesetzt Kammer und die Larven mit UV-Licht für 6 Sekunden bei 20 mJ / cm 2 Intensität. Tauchen Sie die Folie in Wasser zu schweben sanft die Larven aus der doppelseitigen SCOTCh Band. Verwenden einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig platzieren Sie den bestrahlten Larven in einem 15 x 45 mm ein DRAM-Glas Kultur Fläschchen mit ~ 1,0 ml essen fliegen, wo sie für einen variablen Zeitraum (8 -24 Stunden) bei 25 ° C erholen kann oder andere gewünschte Temperatur der Kultur vor der Wiederverwendung der Ernte für die thermische Nozizeption Assays. 3. Lokale Wärme-Sonden-Assay Wir liefern eine schädliche thermische Reiz auf ein einzelnes Segment larvalen Körper mit Hilfe eines speziell angefertigten thermischen Sonde durch Pro-Dev-Engineering (siehe Tabelle der Materialien) hergestellt. Obwohl diese Sonde hat eine optimale Design-Merkmale (eine kleine Metall-Spitze ~ 0,07 mm 2 Fläche und die Fähigkeit, präzise zu halten eine voreingestellte Temperatur von 23 ° C bis 65 ° C) im Prinzip jedes Werkzeug mit einer feinen Spitze, die beheizt werden können auf eine definierte Temperatur für einen Zeitraum von bis zu 20 Sekunden sollte ausreichen. Die Sondenspitze wird verwendet, um frühzeitig 3. Larvenstadium präzise stimulieren auf dem Handrückenl Mittellinie an Abdominalsegment A4 (siehe Abbildung 2). Als Reaktion auf diese thermische Reiz, die Larven im allgemeinen eine aversive Rückzugsverhalten der Walzen seitlich um 360 Grad oder mehr. Dieses Verhalten unterscheidet sich von ihrer leichten Berührung als Reaktion auf eine nicht-schädliche Raumtemperatur Metallsonde, die im Allgemeinen eine kurze Pause in der Bewegungsaktivität 13. Protokoll für die Hitze-Sonde Assay: Voreingestellte Temperatur der thermischen Sonde zum gewünschten Sollwert. Verwenden Sie einen Pinsel oder eine Pinzette zur sanften Übergabe eine individuelle Larve auf eine flache Plattform (wir verwenden in der Regel ein kleines Stück von Vinyl-Schnitt aus einem Bindemittel), auf denen sich die Larven anschließend wird stimuliert. Die Raupe sollte durch einen dünnen Film von Wasser vor dem Kontakt mit der thermischen Sonde erfasst werden. Der Film von Wasser für den Larve sollte so wenig wie möglich und vollständig bedecken die Larve, gleichzeitig sicherzustellen, dass die Larve nicht trocken ist beim Berühren des Vinyl-. Drücken Sie vorsichtig die Sondenspitze gegen die Larve an Segment A4 mit leichtem Druck mit der Spitze in einem 45 ° Winkel zwischen der Sonde und der Oberfläche der Larve (siehe Abbildung 2). Der Druck sollte dazu führen, eine leichte Einbuchtung auf der Oberfläche der Larve und wird in der Regel ausreichen, um Fortbewegung zu verhindern. Wenn die Larve setzt sich zu bewegen, gelten etwas mehr Druck und es wird in der Regel zu stoppen. Nehmen Sie keine Daten aus Larven, die sich bewegen jenseits des Sichtfeldes oder für die ständige Aufsetzen der Sonde nicht, bis die Antwort oder 20 s Cutoff erreicht werden kann. Weiter Stimulierung der Larve bis ein Rückzug Antwort ausgestellt wird oder bis die 20 Sekunden Cutoff erreicht wird, was immer zuerst eintritt. Als Reaktion Larven in der Regel zuerst zeigen eine vorläufige Verhalten hebt den Kopf und Schwanz. Dies wird normalerweise durch den Entzug Verhalten Walzen bei mindestens 360 ° folgt. Nur eine vollständige Rolle von 360 Grad als nozifensiven Verhalten (das vorläufige Heiz hatd oder Schwanz Raise ist nicht). Sobald der Rückzug Verhalten wird Freilassung Kontakt mit der Sonde initiiert und notieren Sie die Latenz oder die Zeit zum Rücktritt. Wenn kein Rückzug Verhalten innerhalb von 20 Sekunden eingehalten wird, dann ist die Larve ist eine Non-Responder. Die Responder können weiter in zwei Kategorien eingeteilt werden. Erfolgt der Rücktritt innerhalb von 5 Sekunden Verhalten gezeigt wird, dann ist die Larve ist ein schnell Responder. Erfolgt der Rücktritt Verhalten zwischen 5-20 Sekunden angezeigt, dann die Larve ist ein Slow-Responder (siehe Abbildung 1 in Babcock, et al. 2009) 1. 4. Globalen Wärme Platten-Assay Die Wärme, Platten-Assay wurde entwickelt, um thermische Nozizeption in Drosophila-Larven zu messen, wenn das ganze Tier mit einem schädlichen thermischen Reiz konfrontiert wird. Individuelle Mitte 3. Larvenstadium werden in einem 80 ul Tropfen Wasser auf einem 60 x 15 mm Petrischale gelegt – siehe Abbildung 3 schematisch und für Fotos von der Assay-Setbis. Die Petrischale wird dann auf einen festen Heizblock (nachfolgend als "Heizplatte") angeordnet ist. Da die Temperatur des Wassertropfens steigt, zeigt die Larve eine Serie von fünf stereotype Verhaltensweisen, die wir Kopf Thrash-, Roll, Peitsche, Beschlagnahme und Lähmung bezeichnet haben. Da diese Verhaltensweisen sind in gewissem Maße eine Funktion der Soll-Temperatur der Heizplatte und dem Volumen des Wassers, in dem die Larve eingetaucht wir hier präsentieren, was wir gefunden haben, um die optimalen Bedingungen (95 ° C Hitze Platte, 80 ul Tropfen sein wird Wasser) für die Einhaltung aller 5 der Verhaltensweisen mit minimaler Überlappung zwischen ihnen. Protokoll zur Wärme-Platten-Assay: Positionieren Sie die Lichtleiter, um sicherzustellen, dass ausreichend hohen Kontrast-Beleuchtung für die Anzeige der Larve. Verwenden Sie eine Test-Larve, wenn nötig. Die Lichtleistung sollte auf niedrig sein, um Umgebungswärme auf der Larve zu testenden zu vermeiden. Setzen Sie den Heizblock in die Heizplatte mit ebenen Fläche nach oben und legen Sie die Heizplatte aufdas Mikroskop Basis. Schalten Sie die Heizplatte auf die "High"-Position, erlauben etwa 15 Minuten für die Temperatur zu stabilisieren, und entsprechend anzupassen, um eine Oberflächentemperatur von 95 ° C erreichen Messen Sie 80 ul destilliertem Wasser und legen Sie die Wassertropfen in der Mitte des 60 x 15 mm Polystyrol-Petrischale mit einer Mikropipette. Verwenden einer Pinzette, um vorsichtig einen sauberen Mitte 3. Larvenstadium in der Mitte des Wassertropfens. Versuchen Sie, die Larve mit dem minimal möglichen Volumen des Wassers so zu übertragen, dass der Tropfen erwärmt werden so nah wie möglich am Original 80 ul bleibt. Sanft legen Sie die Petrischale mit den Wassertropfen und die Larve auf die feste Heizblock auf der Heizplatte. Schnell stellen Sie die Lage der Schale, so dass die gesamte Larve und Tropfen Wasser in Sicht sind. Siehe Abbildung 3 und Videos 1-6. Starten Sie den Timer zum Zeitpunkt der Petrischale wird auf die feste Heizblock der Heizplatte und aktenkundigder Zeitpunkt des Auftretens der einzelnen Verhalten. Falls gewünscht, kann das Verhalten auch Video aufgezeichneten ansehen – Videos 1-5 für repräsentative Beispiele von jedem Verhalten. Leica-Software Version 3.7 für die Aufzeichnung der Filme verwendet wurde, Aufnahme-Modus "Continuous" war, war Kamera 3 Megapixel Auflösung (wir haben 0,63 x Zoom, mit dem die berechnete Bildauflösung beträgt 10 mu m / Pixel) und Bilder / Sekunde waren 44,5. 5. Repräsentative Ergebnisse Lokale Wärme-Sonden-Assay: Beim Kontakt mit der thermischen Sonde, eine Larve zeigt typischerweise eine vorläufige Verhalten zu heben den Kopf und Schwanz. Typischerweise ist das Anheben des Kopfes wird gesehen, gefolgt von der ersten Anheben des Schwanzes. Wenige Sekunden nach dieser vorläufigen Verhalten der Larve beginnt in der Regel seitlich rollen wir nennen das "aversive Rückzug Verhalten." Die Zeit, nach der die vorläufige Verhalten oder die Rücknahme Verhalten gezeigt ist, kann durch Temperatur oder ge variierennetischen Hintergrund. In unserer ersten Studie maßen wir den Prozentsatz von Larven, die aversive Rückzug an verschiedenen Sonde Sollwert Temperaturen und festgestellt, dass 48 ° C die niedrigste Temperatur, bei der alle Larven reagierten schnell (<5 s) war. Hier berichten wir, dass es eine Decke bis zum Larvenstadium thermische Nozizeption Reaktion (Abbildung 4A). 100% schnelle Responder sind bis zu einer Kerntemperatur von 52 ° C beobachtet Jedoch bei 54 ° C und höher, nicht 90% oder mehr der Larven auch nach 20 s Kontakt reagieren. Diese Larven nicht weiter bewegen nach der 20 s Cutoff. Wie bereits erwähnt 1, können die Kategorien von Rückzugsverhalten bei jeder Temperatur aufgetragen und verglichen werden statistisch. Da es sich um eine Verhaltens-Assay ist es eine gewisse Variabilität von Larve zu Larve und zwischen einzelnen Nutzern. Um dies zu berücksichtigen wir messen in der Regel 3 Sätze von 30 Larven pro Versuchsbedingung. Neben der einfachen Kategorisierung von withdrawal Latenz, die wir bereits berichtet haben, berichten wir hier, dass die Amplitude (Anzahl der Rollen oder Zeit in aversiven Rückzugsverhalten verbrachte) kann auch gemessen werden (siehe Abbildung 4). Überraschenderweise scheint es eine inverse Beziehung zwischen der Eingabe der Temperatur und der Robustheit der Reaktion sein, weil niedrigere Temperaturen zu einer höheren Anzahl von Walzen hervorrufen angezeigt (4B) und mehr Zeit verbracht in aversiven Rücknahme (Daten nicht gezeigt). Dies kann darauf hindeuten, dass die Dauer der Exposition gegenüber einer schädlichen Temperatur kann die wichtigste Determinante der Robustheit sein. Heizplatte Assay: Fünf stereotype Verhaltensweisen Bewegungsapparates werden bei Übertragung der Larve in Wasser getaucht, um die Heizplatte beobachtet. Diese werden unten beschrieben und dargestellt in dem Video zusammen mit der typischen motorischen Verhalten eines unbeheizten Larven in Wasser. Die durchschnittliche Latenz bei denen diese Verhaltensweisen beobachtet werden, sind in Abbildung 5 dargestelltA, ebenso die durchschnittlichen Wassertropfen Temperaturen für jede Latenz gemessen. Unter der optimalen Testbedingungen hier präsentierten der Anteil der Larven, die jede einzelne Verhalten reichte von 77 bis 100% (5B), obwohl gelegentlich die Rollen und Verhaltensweisen Schlagsahne weggelassen werden, überschneiden, oder treten in umgekehrter Reihenfolge. Das beobachtete Verhalten, in chronologischer Reihenfolge, werden wie folgt beschrieben und kann in dem Video zu den angegebenen Zeiten unter angeschaut werden: Normale Bewegung in Abwesenheit von Wärme: peristaltische Fortbewegung durch die Suche Kopfbewegungen begleitet. Siehe das Video von 06.27. Leiter Thrash: Larve bewegt den Kopf schnell in einer Vorwärts-oder seitliche Bewegung. Diese Bewegung ist ähnlich wie ihre normalen Fortbewegung im Wasser (siehe Video 1), tritt aber mehr ruckartig und beharrlich. Siehe das Video von 06.40. Roll: Larva rollt seitlich mindestens eine volle 360 °. Siehe das Video von 06.50. Dies kann auftreten,eine variable Anzahl von Zeiten und beinhaltet manchmal unvollständig Rollen. Für die Zwecke des Scoring, das Verhalten wir zählen nur volle 360 ​​°-Rollen. Dieses Verhalten ist das ähnlich wie bei lokaler Anwendung der Wärme-Sonde zu sehen. Whip: Larva Exponate schnelle Kontraktion-Release Bewegungen entlang der anteroposterioren Achse, die den Kopf nur ganz kurz zu bringen in der Nähe des Schwanzes. Siehe das Video von 07.11. Auspeitschen wird oft in schneller Folge oder zur gleichen Zeit wie Walzen beobachtet. Beschlagnahme: Larve erstreckt sich entlang der anteroposterioren Achse und weist eine hohe Frequenz Ganzkörper-Schütteln Verhalten ohne zu verbiegen. Siehe das Video von 07.25. Lähmungen: Larve aufhört Bewegung. In einigen Larven dies ist dauerhaft, während andere dann weisen eine niedrige Frequenz Pulsation Bewegung. Siehe das Video von 07.36. Diese Daten legen nahe, dass die Temperatur des Wassertropfens und die Latenz bis zum Auftreten der fünf characteristic Verhaltensweisen auf globale Erwärmung der Larve / Wassertropfen beobachtet sind stark korreliert. Abbildung 1. Outline of experimentellen Schritte zur Aufbereitung und Analyse von Larven. Vor dem Assay Nozizeption mit der Hitze-Sonde oder der Heizplatte, sind Larven von einer bestimmten Aktie oder genetische Kreuz abgeleitet geerntet und gereinigt von Lebensmitteln. Wenn nozizeptive Sensibilisierung (als Gegensatz zu den Ausgangswerten Nozizeption) zu beurteilen ist, wird von der Ernte Ätherisation (Einwirkung von Äther), Montage-, UV-Bestrahlung und einer Erholungsphase auf Fly Essen gefolgt. Geerntet oder wiederhergestellt Larven werden dann auf schädliche Prüftemperaturen entweder über die Hitze-Sonde (lokal) oder die Heizplatte (globalen)-Assay unterzogen. Zahlen beziehen sich auf Abschnitte der Methoden Text, der den Schritt (e) gezeigt, zu beschreiben. Figure 2. Experimentelle Aufbau für die lokale Wärme-Sonde Assay. Die thermische Sonde wird durch ein thermisches Steuereinheit, die zum Einstellen und Halten der Temperatur der Sonde gesteuert wird. Die Sonde wird senkrecht zu der anteroposterioren Achse gehalten und verwendet, um die Larve in einem Winkel von 45 ° gegenüber der Horizontalen zu stimulieren. Aufsetzen der Sonde richtet sich speziell an Abdominalsegment A4 gemacht, wie dargestellt. Der Benutzer muss diesen Kontakt pflegen mit leichtem Druck bis zum 20 Sekunden oder bis die Cutoff Abrollverhalten beginnt. Wenn die Temperatur als schädlich wahrgenommen wird, wird die Larve zeigen eine aversive Rückzugsverhalten von mindestens einem 360 °-Rolle aus. Die Zahl der Rollen kann einzelne oder mehrere (Siehe Abbildung 4B). Abbildung 3. Versuchsaufbau für Wärme Platten-Assay. (A) Cartoon von einer horizontalen Blick auf das 60 x 15 mm Petrischale mit einer in der Mitte in 3 rdSterne-Larve in einem 80 ul Wassertropfen. (B) Karikatur einer Draufsicht auf die Larve platziert in der Mitte des Wassertropfens als durch das Mikroskop betrachtet. (C) Foto einer horizontalen Ansicht des Arbeitsplatzes für diesen Test. (D) Foto der Larve als durch das Mikroskop betrachtet. Abbildung 4. Die Quantifizierung von Verhaltensreaktionen mit der Sonde Wärme-Assay. (A) Plot des Prozent der Responder, die zu jeder Kategorie (schnell, langsam, und Non-Responder) als Funktion der Temperatur. (B) Auftragung der Latenz zu aversiven Rückzugsverhalten gegen die Anzahl der Rollen jeder Larve an vier verschiedenen Prüftemperaturen zunehmender Schädlichkeit (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C und 52 ausgestellt ° C). Abbildung 5. Wärme-Platten-Assay: Die Latenzzeit und Temperatur vs BehAvior. (A) und der durchschnittlichen Latenz Wassertropfen Temperatur zu jedem Verhaltensreaktion unter den optimalen Bedingungen von 95 ° C (Heizplatte Oberflächentemperatur) und 80 ul Tropfen Wasser (n = 150). Beachten Sie, dass jedes Verhalten innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls beobachtet wird. Wassertropfen Temperaturen wurden unter Verwendung eines Thermoelements in entweder der oberen oder unteren Rand des Tropfens (n ​​= 10 Tropfen für jeden Standort) und diese Messungen eingesetzt wurden gemittelt. (B) Prozent von Larven, die jeden Verhaltensreaktion unter optimalen Testbedingungen. Prügel, die Beschlagnahme und die Lähmung sind fast 100% der Zeit beobachtet, während Roll-und Schlagsahne werden beobachtet 77 und 80% der Zeit, beziehungsweise. Bei niedrigeren Oberflächentemperatur Sollwerte Beschlagnahme und Lähmung nicht innerhalb von 200 s und bei höheren Sollwerten Walz-und Auspeitschung übersprungen werden können oder dürfen gleichzeitig auftreten beobachtet. n = 150. (C) Prozentsatz der Larven, die folgende Einleitung der Lähmung Verhalten zu überleben. Die Larven wurden erhitzt, bis seinfang Lähmung und dann zur Standard-Kulturbedingungen zu erholen entfernt. Mock-behandelten Larven erhielten gleichwertige Behandlung mit Ausnahme von Hitzeeinwirkung. Die Bildung von Puppen und lebensfähigen Erwachsenen wurden an den Tagen 7-13 quantifiziert. n = 120. Abbildung 6. Die Inaktivierung der Larven nozizeptiven sensorischen Neuronen erhöht Verhaltensreaktion Latenzen. Plot der Wartezeit zu jedem Verhalten für die angegebenen Genotypen: W 1118, Gal4-109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C und md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 steuert die Expression der UAS-geregelten Transgene in allen vier Klassen von multidendritic peripheren sensorischen Neuronen, UAS-Ork1.Δ-C 14 drückt eine modifizierte Version des Drosophila offenen Gleichrichter K +-Kanal für die synaptische Übertragung erforderlich ist, und U AS-Ork1.Δ-NC 14 drückt eine weiter modifizierte Version dieses gleichen Kanal, der nicht mit synaptischen Übertragung nicht stört. Beachten Sie, dass nur Larven tragen sowohl der MD-Gal4 Treiber 6 und die UAS-Ork1.Δ-C Transgene zeigen erhöhte Latenzen für vier der fünf beobachteten Verhaltensweisen (Thrash-, Rollen-, Beschlagnahme und Lähmung). Beachten Sie auch, dass aufgrund der erhöhten Latenz zu rollen diese Tiere Peitsche, bevor sie zu rollen. Asterisk bezeichnet p <0,05 nach Student t-Test. n = 30 Larven pro Genotyp. Zusätzliche Video 1. Hier klicken, um Video anzuschauen . Zusätzliche Video 2. Hier klicken, um Video anzuschauen . Zusätzliche Video 3."Target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Video zu sehen. Zusätzliche Video 4. Hier klicken, um Video anzuschauen . Zusätzliche Video 5. Hier klicken, um Video anzuschauen . Zusätzliche Video 6. Hier klicken, um Video anzuschauen .