に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド<em>ショウジョウバエ</em>幼虫

2熱痛覚アッセイのための正常又はUV増感型幼虫を準備するための実験手順の典型的な概要を図1に示されています。 1。幼虫の準備所望の遺伝子型の雄と雌子孫の幼虫を直接テストすることができます。また、遺伝的相互関心のある定義されている遺伝子型の子孫の幼虫を得るために設定することができます。 20から30まで処女雌15〜20人の男性を使用したフライ食品を含むボトルに十字架を設定します。 卵が横たわって5日後、収穫とどろどろフライ食品をすくい、ゆっくりと630μmの（孔径）メッシュを介して流水で緊張によってクリーンな初期の3齢幼虫。飢餓とdessicationを防ぐために食品の小さな湿ったパッドに早期に3齢幼虫（前後軸に沿った長さで3〜4 mm）を転送します。侵害受容感は、テストする場合は、2.1から2.11以降の手順に従います。幼虫はabsencでテストする場合は組織損傷のeは、3.1のステップに進んでください。 2。エーテル麻酔し、UV照射エーテル麻酔室を構築します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブの底を切り取ります。 熱い金属のヘラでマイクロ遠心チューブのカットエッジを溶かす。 溶融管表面に貼り細かいメッシュを、冷却することができます。エーテル麻酔チャンバーは、エーテルの煙の進入を許可し、幼虫の脱出を防ぐことができます。 優しくホームメイドエーテル麻酔チャンバー内の10の初期3齢幼虫を配置する鉗子またはペイントブラシを使用しています。 蓋閉じの内側に沿って場所の幼虫。 注：エーテル爆発の恐れのある化学物質であり、その煙は人間と同様に幼虫を麻酔することができますように次の2つの手順はドラフト内で行う必要があります。 携帯10mlのビーカーを含むコプリンジャー内部の幼虫を含むエーテル麻酔チャンバーを配置コットンボールはジエチルエーテルの〜1.5 mlを浸した。 2から2.5分間エーテルフュームに幼虫を公開するコプリンジャーのキャップをします。長いエーテル麻酔時間が悪影響を幼虫の行動や生存に影響を与える可能性があることに注意してください。 エーテル麻酔後、放散するエーテルの蒸気用フードに数秒を与えて、コプリンジャー/ビーカーからエーテル麻酔チャンバーを削除します。あなたは今、ラボに戻ってボンネットから移動することができます。 そっと小さなペトリ皿にエーテル麻酔室から幼虫をすすぐために水の噴出ボトルを使用しています。 麻酔幼虫は乾燥し、3 "×1"ガラス顕微鏡スライドに固定両面スコッチテープのストリップ上に穏やかに貼るそれらの背側を覆い隠すために鉗子とキムワイプを使用しています。 UV照射室の底面にスライドを置き、20 MJ / cm 2の強度で6秒間紫外線に幼虫を公開します。 軽く両面scotcの幼虫をオフにフロートを水にスライドを浸すhのテープ。 静かに彼らが25℃時の変数の期間（8 -24時間）°Cを回復することができますフライ食品の〜1.0 mlを含む15×45ミリメートル1ドラムのガラス培養バイアルに照射された幼虫を配置する鉗子や絵筆を使用するか、熱痛覚アッセイの再収穫する前に、他の所望の培養温度。 3。ローカルヒートプローブアッセイ我々は、Pro-Devに工学（材料の表を参照）によって製造された特注のサーマルプローブを使用して、個々の幼虫の体セグメントに有害な熱刺激を提供します。このプローブは、原則として、最適な設計上の特徴（〜0.07ミリメートル2の面積の小さな金属製のチップと正確に23°Cから65°Cに設定温度を維持する能力）を加熱することができる小型のチップで任意のツールを持っていますが最大20秒までの期間の定義された温度に十分でなければなりません。プローブの先端はdorsumの複数形で正確に早く第3齢幼虫を刺激するために使用されます腹部のセグメントA4でLの正中線（ 図2を参照）。この熱刺激に応答して、幼虫は一般に360度以上横方向に圧延の嫌悪離脱動作を示します。この動作は一般的に運動器官の活動の13の短い一時停止を含む、非有害な室温の金属プローブへの軽いタッチレスポンスとは異なります。 ヒートプローブアッセイのためのプロトコル： 希望するセットポイントへの熱プローブの事前設定温度。 そっと幼虫が続いて刺激される上に平らプラットフォーム（私たちは通常、バインダーからビニールカットの小片を使用）に個々の幼虫を転送するために絵筆やピンセットを使用しています。幼虫は、サーマルプローブと接触する前に水の薄膜で覆われるべきである。ビニールに触れたときに幼虫が乾燥していないことを確保しながら、幼虫を覆う水の膜が、可能な限り少ない、完全に幼虫をカバーしなければなりません。 優しくプローブと幼虫の表面（ 図2を参照）の間に約45°の角度で先端の光の圧力を適用するセグメントA4で幼虫に対するプローブの先端を押してください。圧力は、幼虫の表面上のわずかなくぼみが発生する必要があり、通常は移動を防ぐのに十分であろう。幼虫が移動し続けている場合は、多少の圧力を適用すると、通常は停止します。ビューまたは一定のプローブコンタクトのフィールドを超えた動きが応答または20秒のカットオフまで達成することができない幼虫からのデータを記録されません。 撤退の応答が展示されるまで、または20秒のカットオフに達するまで、幼虫を刺激し続けて、いずれかが最初に発生します。幼虫を応答すると、通常、最初の頭と尾を持ち上げての予備的な動作を示しています。これは通常、少なくとも360度回転の離脱行動が続いている。唯一の360度の完全なロールをnocifensive動作（予備HEAとして採点されるdまたは尾レイズ）ではありません。 一度撤退の動作は、プローブとの接触を解放し、撤退に待ち時間や時刻を記録が開始されます。なく撤退の動作は20秒以内に観察されない場合は、幼虫は、非応答者です。レスポンダーは、さらに2つのカテゴリに分けることができます。撤退の動作が5秒以内に表示されている場合、幼虫は、高速応答者です。撤退の動作は、5月20日秒の間表示されている場合、幼虫は、低速の応答（バブコックら 、2009年に図1を参照）は1です。 4。グローバルヒートプレートアッセイ熱プレートアッセイは、全体の動物が有害な熱刺激に直面されたときに、ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚を測定するために設計されています。アッセイセットの回路図と写真図3を参照してください-個々の半ば第3齢幼虫は、60×15ミリメートルのペトリ皿に水80μlのドロップに配置されているアップ。ペトリ皿は、その後、固体加熱ブロック（ "熱板"と呼ばれる）に配置されます。水滴の温度が上昇するとして、幼虫は、我々が頭のスラッシュ、ロール、鞭、発作、麻痺と呼ばれた5つの紋切り型の行動のシリーズを示す。これらの行動はある程度熱プレートの設定温度と我々は最適な条件（95℃の熱板、80μlのドロップであることが判明したものをここで紹介する幼虫を浸漬されている水の量の関数であるとして水）、それらの間の最小限の重複での行動の全て（5件）を観察するため。 熱プレートアッセイのためのプロトコル： 幼虫を表示するための十分な高コントラスト照明があることを確認するために、光ファイバライトガイドを置きます。必要に応じてテストの幼虫を使用しています。光パワーは、テストする幼虫に周囲の熱を避けるために低い上になければなりません。 平らな面を上にして耐熱皿に加熱ブロックを配置し、熱板上に置く顕微鏡ベース。 "高"の位置に熱板の電源をオンにし、温度は約15分安定させるため、95℃の表面温度を達成するために適宜調整蒸留水80μlを測定し、ピペットで60×15 mmのポリスチレンペトリ皿の真ん中に水滴を置きます。 優しく水滴の中央にきれいなミッド第3齢幼虫を配置する鉗子を使用しています。できるだけ近くに、元の80μlに加熱されるドロップが留まるように水の最小可能なボリュームで幼虫を転送しよう。 静かに熱板上に固体の加熱ブロックの上に水滴や幼虫を含むペトリ皿を置きます。全体の幼虫と一滴の水がビューになるように、すぐに皿の位置を調整します。 図3およびビデオ1-6を参照してください。 現時点ではペトリ皿は、固体加熱用熱板のブロックおよびレコードの上に配置されているタイマーを起動します。各動作の開始の時間。必要に応じて、行動には、ビデオ記録することができます-それぞれの行動の代表的な例については、 ビデオ1-5を参照してください。ライカソフトウェアバージョン3.7は、ムービーを記録するために使用され、録音モードが "連続"でしたが、カメラの解像度は3メガピクセルであった（我々が計算された画像の解像度が10μm/画素であると0.63xズームを使用）とフレーム/秒は44.5であった。 5。代表的な結果ローカルヒートプローブアッセイ： サーマルプローブと接触すると、幼虫は通常、頭と尾を持ち上げての予備的な動作を示しています。一般的に頭の解除は、最初の尾を持ち上げるに続いて見られている。幼虫は通常、我々としてを参照している横方向にローリングを開始 "嫌悪撤退の動作。"この予備動作の後に数秒予備動作や撤退の動作が表示されるまでの時間は、温度またはGEによって異なる場合がありますnetic背景。私たちの初期の研究では、異なるプローブセットポイント温度で嫌悪撤退を示す幼虫の割合を測定し、48°Cは、すべての幼虫が（<5秒）の高速応答した最低温度であることがわかった。ここでは、幼虫の熱侵害受容応答（ 図4A）に天井があることを報告します。 100パーセント高速の応答は、52℃のプローブ温度まで観測されているしかし、54°C以上では、幼虫の90％以上は、連絡先の20秒後でも、応答に失敗する。これらの幼虫は、20のカットオフ以下の移動を続けないでください。 以前は1で述べたように、各温度での撤退行動のカテゴリはプロットと統計的に比較することができます。これは行動アッセイであることを考えると幼虫から幼虫へと個々のユーザーの間にいくつかの変動があります。このことを考慮するために、我々は、通常試験条件あたり30幼虫の3セットを測定します。 wiの単純な分類に加えて我々が以前に報告されていることをthdrawal待ち時間は、我々は、振幅が（ロール状又は嫌悪撤退行動に費やした時間数）にも（ 図4を参照）を測定することができたので報告する。驚くべきことに、より低い温度は、ロールの数が多い（ 図4B）と嫌悪撤退（データは示さず）に費やされた多くの時間を引き起こすように見えるため、入力温度と応答のロバスト性の間に反比例の関係があるように表示されます。これは有害な温度への曝露期間は堅牢性の主要な決定因子であることを示している可能性があります。 熱プレートアッセイ： 五紋切り型の運動器官の挙動は、熱板上に水に浸漬幼虫の転送時に観察されています。これらは以下に説明し、水に非加熱幼虫の典型的な運動器官の動作と一緒にビデオに示されています。これらの行動が観察される平均待ち時間を図5に示されているとして、それぞれのレイテンシを測定した平均水滴の温度があります。最適なアッセイ条件はここで紹介するの下に時折ローリングとホイップ行動は、重複を省略する、またはその逆の順序で発生されていますが、それぞれ異なる挙動を示す幼虫の割合は77％から100％（ 図5B）であった。観察行動は、時系列順に、次のように記述されており、以下に示す時間にビデオで見ることができます。 熱の非存在下での通常の動き：頭部の動きを探索することによって伴う蠕動運動。 6時27分からのビデオを参照してください。 ヘッドスラッシュ：幼虫の移動は、順方向または横方向の動きに素早く向かう。この動きは、水中では通常の運動（ ビデオ1を参照）と似ていますが、よりjerkilyと永続的に発生します。午前6時40分からのビデオを参照してください。 ロール：幼虫が横方向に少なくとも360°をロールバックします。 6時50分からのビデオを参照してください。これが発生する可能性があります変数の回数、時には不完全なロールが含まれます。行動得点の目的のために我々は唯一の完全な360°ロールをカウントします。この動作は、ヒートプローブのローカルアプリケーションで見られると最も類似している。 ホイップ：尾に近い非常に簡単に頭を持って前後軸に沿って幼虫の展示の急速な収縮リリースの動きを。 7時11分からのビデオを参照してください。鞭打ちは、多くの場合に立て続けにまたは圧延と同時に観察される。 発作：幼虫は、前後軸に沿って伸び、曲げずに高周波全身揺れ動作を示します。 7時25分からのビデオを参照してください。 麻痺：幼虫は動きを停止します。他の人がその低周波脈動の動きを示す一方、いくつかの幼虫では、これは永続的です。 7時36分からのビデオを参照してください。 これらのデータは示唆している5 charの発症までの水滴と遅延の温度幼虫/水ドロップ地球温暖化の際に観察acteristic動作は非常に相関している。 図1。幼虫の調製と分析のための実験手順の概要 。前のヒートプローブまたは熱板で痛覚を測定するには、特定の株式や遺伝的交雑から派生した幼虫を回収し、食品の洗浄されています。侵害感が（ベースライン痛覚とは対照的に）評価される場合には、収穫はエーテル麻酔（エーテルへの曝露）、マウント、UV照射、フライ食品の回収の期間が続いている。収穫または回復した幼虫は、どちらのヒートプローブ（ローカル）または熱板（グローバル）アッセイを用いて有害な試験温度にさらされます。数字が示すように、ステップ（s）を記述するメソッドのテキストのセクションを参照してください。 FigurE 2。実験は、局所的な熱プローブアッセイのために設定します。ヒートプローブは、プローブの温度を設定し、維持するために使用される熱制御ユニットによって制御されています。プローブは前後軸に垂直に保持され、水平方向に45°の角度で幼虫を刺激するために使用されています。に示すようにプローブの接触は、腹部のセグメントA4で具体的にされています。ユーザーが20秒カットオフまで、または、ローリング動作が始まるまでの穏やかな圧力まで、この接触を維持する必要があります。温度は有害と認識されている場合は、幼虫は、少なくとも一つ360°ロールによって特徴付け嫌悪撤退の動作が表示されます。ロールの数が（ 図4Bを参照してください）が、1つまたは複数にすることができます。 図3。実験的な熱プレートアッセイのためのセットアップ 。 （A）60×15ミリメートルのペトリ皿の水平方向のビューの漫画の内の1つの中旬第3 回を含む80μlの水滴のスター幼虫。 （B）の幼虫のトップビューの漫画は、顕微鏡を通して見た水滴の中央に配置されています。このアッセイのためにワークステーションの水平方向のビューの（C）写真。 （D）の幼虫の写真は、顕微鏡を通して見た。 図4。ヒートプローブアッセイを用いて行動反応の定量化。（）は、各カテゴリ（高速、低速、非レスポンダー）対温度に属する回答者のパーセントのプロット。 （B）それぞれの幼虫が増加して有害性の4つの異なる試験温度（42°C、44°C、46°C、48°C、50°C、52出展ロールの数に対する嫌悪撤退の動作に遅延のプロット°C）。 図5。熱プレートアッセイ：レイテンシーと温度対BEHavior。（）待ち時間と平均的な水は95°C（ホットプレートの表面温度）と水80μlのドロップ（N = 150）の最適な条件の下で各行動反応温度をドロップします。各動作は、特定の時間間隔内で観察されることに注意してください。水滴の温度は平均化された最上部または最下部のドロップ（各場所のためにはn = 10滴）、およびこれらの測定値のいずれかに挿入された熱電対を用いて測定した。 （B）の幼虫の割合は、最適なアッセイ条件下で、それぞれの行動反応を示す。ローリングとホイップそれぞれ77時間の80％を、観察している間、スラッシング押収し、麻痺は時間のほぼ100％を観察しています。低い表面温度のセットポイントの発作と麻痺でローリングとホイップスキップすることができ、または同時に発生する可能性があります200秒以内と高セットポイントで観測されていません。 N = 150。 （C）麻痺の動作は、次の開始を生き残る幼虫の割合。幼虫があるまで加熱した綿繰り麻痺し、回復するために、標準培養条件に削除されます。モック処理幼虫は熱への暴露を除いて同等の治療を受けた。蛹と実行可能な大人の形成は、日7-13定量した。 N = 120。 図6は、幼虫侵害受容感覚ニューロンの不活化は、行動の応答待ち時間を増加させます 。指定された遺伝子型の各動作に遅延のプロット：1118ワット 、GAL4 109（2）80 = MD-GAL4 / +、UAS-Ork1.Δ-C / +、UAS-Ork1.Δ-NC / +、MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C、とmd-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC。 multidendritic末梢感覚神経のすべての4つのクラス内のUAS-規制の導入遺伝子のMD-Gal4のドライブ式、UAS-Ork1.Δ-C 14は、シナプス伝達に必要なショウジョウバエオープン整流K +チャネルの修正バージョンを表し、U AS-Ork1.Δ-NC 14はシナプス伝達を妨げることはありません、これと同じチャネルをさらに修正したバージョンを表しています。 MD-Gal4のドライバ6とUAS-Ork1.Δ-Cの導入遺伝子の両方が付いただけの幼虫は、5つの観測された行動（スラッシュ、ロール、発作、麻痺）の4つのために増加の待ち時間を表示してください。注意しても、そのため彼らはロールバックする前に、これらの動物の鞭を圧延に増加した待ち時間の。アスタリスクは、スチューデントのt検定によりp <0.05を示します。遺伝子型ごとにn = 30の幼虫。 補足ビデオは、1。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。 補足ビデオ2。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。 補足ビデオ3。"ターゲット=" _blank ">ビデオを見るにはここをクリックしてください。 補足ビデオ4。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。 補足ビデオ5。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。 補足ビデオ6。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。