Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

1. GP 120, Etiketleme Bu protokolde kullanılan floresan boyalar, proteinlere bağlanarak etkili olan mikroskobik görüntüleme için yeterince fotoğraf stabil durumda ve bizim mikroskop ile kullanılabilir lazerlerin dalga boyları uyarma maç. Etiketleme proteinler için floresan moleküller seçerken Bu üç kriter yerine getirilmesi gerekir. Döviz Onun gp120 DH12 (Dr. Michael Cho, Iowa State Üniversitesi tarafından hediye) santrifüj filtre ünitesi (30 kDa MWCO) ile steril PBS protein tampon 6-etiketli. Gp120 konsantrasyonu fazla 1 mg / ml olmadığından emin olun. Not: Onun 6-etiketli diğer X4 veya R5 tropik suşları gp120 proteinler de test edilmiş ve ticari İmmün Technologies şimdi mevcuttur var. ~ PH 8.5 olan sodyum bikarbonat 50mM son konsantrasyon elde etmek için protein çözeltisine sodyum bikarbonat pH 9.0 ekleyin. Di amin reaktif Alexa Fluor 488 (AF488) floresan boya, ekleBir 10-kat molar fazlalıktan az su içinde ssolved. Karanlık oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bu karışım inkübe. Fazla boya kaldırmak için, daha önce olduğu gibi santrifüj filtre ünitesi kullanın ve sütun taze steril PBS ekleyin. Tüm ücretsiz boya (4 ml PBS ile 3-4 yıkar) kaldırılıncaya kadar bu adımı yineleyin. Gp120 yaklaşık 1 mg / ml 'ye kadar konsantre edilir aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Not: boya suda çözünür ya da başka bir jel filtrasyonu kullanılabilir ise diyaliz veya santrifüj filtre ünitesi tarafından serbest boya çıkarma çalışır. Etiketli protein proteini (F / P) bir molekül başına floresans yoğunluğunu ölçmek için, uygun dalga boyunu (örneğin, AlexaFluor 488 için 488 nm'de) ve protein olarak floresan boya konsantrasyonları (uM cinsinden) (kullandığımız belirlenmesi ardından 'protein ve etiketleri' ayarı) kullanarak ve bir NanoDrop spektrofotometre Eğer F / P oranı veren bu iki sayının bölün. Aynı prosedür gibi ICAM-1 ve Cy5 gibi diğer proteinler ve boyalar için kullanılır. Not: spectroph diğer tipleriotometers bir NanoDrop mevcut değilse, F / P oranı elde etmek için protein konsantrasyonunu ve floresanslı boya konsantrasyonu elde etmek için kullanılabilir. 2. Akış Hücre Montaj ve çift-katlı Hazırlık Akış hücresi ve çift-katlı hazırlanması için genel prosedür, daha önce 14 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Burada bir Bioptech akış hücresi üzerine yaptığı 6-etiketli gp120 DH12 içeren bilayers hazırlamak için özel protokol özetlemektedir. Bulaşıcı virüsler veya enfekte olan hücreleri içeren çalışmalar için ve ne zaman küçük miktarlarda sınırlı reaktifler, bir tek Ibidi akışı odası (yapışkan Slayt I 0.2 Luer) nedeniyle gerekli adımlar 2,4-2,9 aynı çift katmanlı hazırlık prosedürü ile kullanılır ve takip edilebilir. Ibidi akışı odaları için bilgi şirketin web sitesi, elde edilebilir http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </a>. Pirhana çözeltisi (45 ml sülfirik asit (Trace Metal derecesi% 98) ve 15 ml% 30 hidrojen peroksit) 14 hazırlayın. Plastik kelepçeleri ile batırmayın kapağı 15 dakika Pirhana çözüm kayıyor. Pika-saf su ile dolu bir behere kayar kapağı ve 2 dakika (her bir tarafta bir dakika) için akan suyun altında her biri yıkayın aktarın. Kuruması için raf üzerine yerleştirin. Daha önce açıklandığı gibi 14 Bioptechs FCSII odaları birleştirin. % 12.5 ihtiva eden bir lipozom karışımı Ni 2 + şelatlama lipidler 16 yakalama ve iki tabakalı bir yüzeye His 6-gp120 sunulması için kullanılır. Cama ucu dokunmadan microaqueduct slayda lipozom karışımından 1 ul damla ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi, 14, beş nokta 1μl vardır, böylece akış hücre başına 5 bilayers maksimum hazırlamak için, 4 kez daha fazla tekrar edin. Lipidler üstüne kapak kayma yerleştirin. Paslanmaz çelik bir cl ile beyaz tespit bileziği Kapakamp ana ünite üzerinden tüm aparatları çevirmek ve mühür. Bir işaretleyici ile bilayers yeri işaretleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe. Video 'de gösterildiği gibi, sol perfüzyon tüp için iki-yollu ile tüp takın. 50 ml 10x HBS [10x: Üzerinde 3-yollu (tüp daha önce insan serum albumini (HSA) (HBS / HSA içeren Hepes tamponlu salin (HBS) dolmuştur ile tüp sonunda olumlu bir menisküs üret HEPES tamponlu tuzlu: 200 mM HEPES, pH 7.2, 1.37 M NaCl, 50 mM KCI, 2 HPO 4 Na 7 mM, 60 mM D-glukoz] 20 ml 25x HSA, 500 ul 1M CaCI2, 1 ml 1 M MgCl2 ve dH 500ml ve 0.22μm filtre ile filtre) bir toplam hacim getirmek için 2 0 ve kabarcıklar yoksundur. sağ perfüzyon tüpü hortumu bağlayın ve yavaşça akış hücresi ile tampon itin. 1 ml şırınga doldurma ve 3-yollu bir açık kısmına takarak 100 uM NiCl 2 içeren kazein ~ 300 ul ile iki tabakalı engelleyin. Gently yoluyla tampon itin ve şırınga boşaltırken önce her iki stopcocks kapatın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. His 6-etiketli AF488-etiketli gp120 (konsantrasyon olarak 16 in daha önce tarif belirlenir) eklenir. Biz HIV-1 virionu yüzey 17'de bulunabilir env kümelerin yerel yoğunluk taklit etmek gp120/μm 2 ~ 250 moleküllerdir. Daha önce 14 olarak bildirilen Benzer şekilde, iki tabaka üzerine ~ 250 molekülleri / um ICAM-1 2 kullanın. Kazein ile yapılabilir gibi akış hücre içine yerleştirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika (folyo ile kaplayın) inkübe. Aynı prosedür gibi His-12 etiketli iki tabakalı üzerine ICAM-1 Cy5-etiketli gibi diğer proteinler ayırmak için kullanılır. Tampon 5 ml bilayers yıkanır. 3. FRAP üzerinden Bilayers Kalite Kontrolü Bilayers Proteinler yanal yayılabilir olmalıdır. Bilayers üzerine hücreleri eklemeden önce, bu temin etmek önemlidirHazırlanan iki tabakalı proteinlerin hareketliliği. Burada konfokal mikroskoplar tarama TIRF, geniş alan Epifloresans veya lazer ışıklı en objektif üzerinde elle yapılabilir (FRAP) yöntemi 3 Photobleaching sonra Floresan Kurtarma açıklar. Amaç çift katlı lipid, ağartıcı bir nokta, ve ağartılmış alana unquenched moleküllerin dönüş izlemek için floresan görüntü tamamen homojen alanları etmektir. 2 dakika içinde% 50'lik bir geri kazanım kabul edilebilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır objektif ışıklı TIRF sistemleri satmak. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. Ağartma en aza indirmek için düşük uyarım yoğunluğu kullanın. Böyle bir NA 1,3-1,45 40x, 60x veya 100x gibi yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Işık intens azaltmak için, standart bir floresan veya TIRF mikroskobu kullanılarak zamanSığ, uyarma ışık yolu nötral yoğunluk filtreleri koydu. Çoğu lazer sistemleri düşük voltaj ile akusto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) veya akusto optik ışın ayırıcı (Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor) ayarlayarak düşük aydınlatma için ayarlanmış olabilir. Bir "ön-bleach" görüntü kaydedin. Düşük ışık koşullarında binning telafi etmek için, soğutmalı bir CCD kamera ile 2×2 veya 4×4 olarak ayarlanmış olabilir Eğer kazanç kullanılabilir, yüksek ya da uzun pozlama (saniye sırasına örneğin) ayarlanmış olabilir. Bir konfokal kullanıyorsanız, iğne deliği diyafram açılabilir; kazanç yüksek ayarlayın ve yavaş tarama veya kullanılan ortalama. Bleach bir nokta. Standart bir floresan veya TIRF mikroskop kullanıyorsanız, maksimum şiddeti aydınlatma sağlamak için tüm ND filtreleri kaldırırsanız, alan diyafram kapatın ve birkaç saniye için örnek maruz bırakmaktadır. Konfokal tarama bir lazer kullanarak, ağartıcı bir noktaya 8x yaklaşık 4x lazer güç ve maksimum zoom ayarı. Eğer Konfokal kullanımı için bir uyarı: çok yüksek yakınlaştırma değil iki tabakalı dizgin zarar görebilir çünkügeniş anlamda kullanılmaktadır fotonlar yoğunlaştı. On on beş saniye aralıklarla, görüntü kaydetmek 3.1 ve 3.2 ile aynı aydınlatma ve kayıt ayarlarını kullanarak. Iki üç dakika içinde nokta "ön-bleach" görüntünün ancak yaklaşan yoğunluğu kurtarmak gerekir. Hızlı kurtarma başarılı bir mobil çift-katlı bir işaretidir. Spot karanlık kalırsa kenarı yüksek kontrast koruyorsa, ve özellikle, floresan proteinleri iki tabakalı hareketsizse ve deney için kullanılmamalıdır. Not: Mevcut mikroskop, biz 4 saniyeden daha kısa sürede tipik konsantrasyonlarda floresan ICAM açıcılar 240 mikron 2 lik bir alana sahip dairesel bir noktaya 641 nm ışık 0.9 mW sunabilirsiniz. Okuyucular 30 saniyeden az bir kez tekrarlanabilir bir şekilde bu testte gerçekleştirmek için fazlasıyla yeterlidir beyazlatma ile bir Hg veya Xe lamba kritik uyum bulmalısınız. Ayrıca ek det için 3 başvuru için sevk edecekleriniyerli diziler. 4. Hücreler ve İmmünofloresan Boyama Enjeksiyon 37 ° C (bu, yaklaşık 30 dk için bir CO 2 ile 37 ° C inkübatörde yapılabilir) ile akış hücresi ısınmaya. 1 ml şırınga ile aktive insan CD4 + HBS / HSA ~ 400 ul T hücrelerinin (2-5×10 6 / akış hücresi) ekleyin. Hücreler 37 ° C inkübatörde ~ 45 dk için çift-katlı eklemek edelim. Ibidi odaları kullanılması durumunda, ek tampon her 15-20 dk kaynağı. % 2 paraformaldehit enjekte edilerek hücreleri düzeltmek ve 37 de 10 dakika inkübe ° C. 1 ml oda sıcaklığında PBS tamponu ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri enjekte edilerek geçirgenliği. Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml (fosforile proteinlerin sondalama zaman, işleme sırasında fosfat kaldırılmasını önlemek için PBS 1mM son konsantrasyon veya başka bir fosfataz inhibitörü sodyum vanadat ekleyebilirsiniz) 3x yıkayın. Için% 5 keçi serumu ile kazein kullanarak engellemeOda sıcaklığında 25 dak. Hayvan serumu tipi sekonder antikor bağlıdır. Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat – 30 dk için ~ 300 ul tamponu / akış hücresi olarak primer antikorun ekleyin. İlk zar-proksimal aktivasyon sinyali algılamak için, LCK total veya Fyn, (pLck) lck fosforile için özel antikorlar kullanır. Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Primer antikor ile yapılan tampon olarak uygun floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor ekleyin. Bizim deneyler için, keçi anti-tavşan sekonder 568-etiketli Alexa Fluor kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Not: Sadece sekonder antikor (hiçbir birincil antikor) ile tedavi edilmiş bir kontrol çift katlı olması şarttır. Adımları 4.1-4.5 ve 4.6 atlama izleyin, sonra adım 4.7 ile devam edin. Bu ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanma seviyesinin belirleyecektir. Alternatif olarak, bir etiket, doğrudan kullanabilired primer antikorlar. 5.. TIRF mikroskopi ile görüntü alma TIRF mikroskopisi, bir 250 nm ya da cam substrat ve hücre ara yüzeyde ince düzlemi ile sınırlı flüoresan sinyallerin eksitasyon sağlar. Bu çift katlı lipid gelen ve hemen apposed hücre zarları sadece sinyallerin görüntü alımı garanti eder. Bu nedenle, sinaps sadece moleküller görüntülenmiştir edilir. Hücre altındaki TIRF görseller membran-proksimal alanı için, dorsal membran içine içselleştirmiş veya yeniden dağıtılır proteinleri tespit edilmez. Daha sonra ek olarak, standart Geniş açılı, ya da diğer hücre birimleri ile karşılaştırıldığında birikimi ya sinaptik alanda proteinlerin dağılımını saptamak için konfokal mikroskopi ile görüntü elde etmek için önemli olabilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu ap için işe objektif ışıklı TIRF sistemleri satmakplikasyon. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. Her TIRF mikroskop çalışması için kendi ayrıntıları vardır, ama aşağıdaki genel kurallar yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için geçerlidir. Aydınlatma ağartma önlemek için düşük olmalıdır. Kamera lineer bir cevap olmalıdır. Kamera hiçbir doygunluğu ile görüntüleme geniş dinamik aralık yeteneğine sahip olmalıdır. Tüm ayarlar kantitatif analizleri için sürekli ayarlanması gerekir. 6. Veri Analizi CD4 + VS de gp120 ile T hücre etkileşimi sonucunda aktif hücre içi sinyalleri incelemek için, TIRF görüntüleri kantitatif analizleri gibi aktif ve sinaps 15 alınırlar lck ve Fyn gibi olsun ya da hücre içi sinyal molekülleri belirlemek için yapılır. Burada çoğu görüntü analizi için uygulanan basit bir yöntem tarifBöyle ImageJ ve Metamorph gibi uygulama paketleri. Biz burada yöntem 12 için Windows, Macintosh ve Linux üzerinde çalışan ImageJ, kullanmışlardır. Analyze> Set Ölçümleri sekmesinde, Alan için onay kutularını ve gri Ortalama değer. Bir çokgen veya bir serbest izlenen kapalı şekli resmin üzerine ilgi bir bölge yapmak ve> Ölçü analiz ne zaman, yazılım bir sonuç tabloda bu ölçüm verileri koyacağız. Alan piksel sayısında ya da 2 um olacaktır. Ortalama keyfi birimler ortalama yoğunluğudur. Bunun çıkarılır arka yoğunluğu sahip olması gerekir. Alanı tarafından ortalama çarparak eksi arka keyfi bir birim içinde proteinin entegre yoğunluğu döner. Ortalama ve Alan için ölçümleri ayarlayın. Bir deney durumu için görüntüleri açın. Her hücre için, takip ve ilgi (ortalama) bölgesi ölçmek ve izlemek ve faiz (arka plan) bölge dışında bir bölgeye ölçmek. Zaman, bir deney koşulu ile kopya ölçümleri da yapılıyor ve Excel ya da diğer elektronik tablo programı içine yapıştırın veya ölçümleri kaydedin. Her deneysel koşul için 6.2 adıma geri dönün. Ölçümler tamamlandığında, sonuçları hesaplamak. Formül şunlardır: Ortalama yoğunluğu = ortalama – arkaplan Entegre yoğunluğu = Ortalama yoğunluğu * alan 7. Temsilcisi Sonuçlar VS azından gp120 ile etkileşimi sonucu olarak, başlangıç ​​membran-proksimal sinyalleşme LCK molekülleri ve Fyn aktivasyonu ve alım ölçmek için, birincil insan CD4 + T hücreleri gp120 ve ICAM-1 15 taşıyan bilayers üzerine getirilmiştir. Sadece ICAM-1 ile bilayers tanıtıldı Hücreler sinyal bazal düzeylere tanımlamak için bir kontrol olarak görev yaptı. Specific floresans yoğunluğunu ICAM-1 çift-katlı ile etkileşen hücreleri için gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers ve bütün temas alanı içinde hücreleri için gp120 temas alanı içinde ölçülmüştür. Ortalama floresan yoğunluğunda bir artış, bir genişletilmiş işareti işe alım ve VS sinyal molekülünün aktivasyonu. Bu, daha da entegre floresans yoğunluğunu benzer bir artış ile gösterilecektir. Bununla birlikte, entegre floresans yoğunluğunu herhangi bir değişiklik olduğunda ise, bu sinyal molekülünün bir dağıtılması gösterir. Hücreleri gp120 ve ICAM-1, lck toplam ve pLck (Y394) içeren bilayers etkileşim sonra VS arayüzü alınan ve gp120 (Şekil 1 ve 2) ile kolokalize edildi. LCK toplam ortalama yoğunluğu (Şekil 1) tek başına ICAM-1 ile daha gp120 ve ICAM-1 hem de içeren iki tabaka daha yüksek, ama entegre yoğunluk seviyeleri (Şekil 1) benzerdi, lck içine yeniden dağıtılır düşündürmektedirCD4 + T hücre gp120 bağlama üzerine merkezi bir küme. Ancak, pLck (Y394) (Şekil 2) miktarının gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers üzerinde ortalama yoğunluğu ICAM-1 tek başına bilayers üzerinde daha yüksek olduğunu gösterdi ve entegre yoğunluğu gp120 ve ICAM her ikisi ile bilayers daha yüksek oldu -1 ICAM-1 tek başına bilayers ziyade. Arayüzünde lck toplam seviyeleri gp120 ve ICAM-1 ve ICAM-1 tek başına bilayers, aktivasyon döngü lck az kalıntı Y394 ve gp120 bağlayıcı artış fosforilasyon üzerine yapışan hücreler benzer iken bu olduğunu gösterir. Bunun aksine, Fyn fazla gp120 Fyn ve ICAM-1 hem de ihtiva bilayers üzerinde daha ICAM-1 tek başına bilayers üzerine hücrelerinin temas alanında mevcut olduğu gibi, (Şekil 3) VS için işe değildi. Sonuç olarak, Fyn değil, lck, HIV-1 gp120 kaynaklı VS aktif kinaz olduğu sonucuna varıldı. Şekiller: at Membran-proksimal sinyal HIV-1 gp120 kaynaklı VS. Üzerindeki temsilcisi hücrelerin Görüntülerigp120 + ICAM-1 çift-katlı (üst panel) ve ICAM-1 çift-katlı (alt paneller) gösterilmektedir. Şekil 1 'de sarı bir çizgi ile işaretlenmiş bölge tarafından gösterildiği gibi, tek tek hücrelerin floresans yoğunlukları hücre izlerin bir elle takip alanları içinde ölçüldü. TIRF mikroskopi ile saptanan ortalama yoğunluğu ve entegre Kantitasyonu, sırasıyla, sol ve sağ grafik olarak gösterilmiştir. 30-350 hücreleri toplam, her durum için ölçüldü. Barlar = 5 mm. Üç tekrarlama deneyler birindeki verileri gösterilmiştir. Şekil 1. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve LCK toplam boyanmıştır. Şekil 2. CD4 + T hücreleri iki tabakalı üzerine tanıtıldıs 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren ve daha sonra pLck (Y394) için ve lekeli sabitlenir. Şekil 3. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve toplam Fyn için boyanmıştır.