合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

1。 gp120をラベリングこのプロトコルで使用されている蛍光色素は、タンパク質に結合するのに有効である顕微鏡イメージングのために十分に安定した写真であり、私たちの顕微鏡で使用可能なレーザの励起波長と一致しています。タグタンパク質の蛍光分子を選択する際にこれら3つの条件が満たされる必要があります。 遠心フィルターユニット（30 kDaのMWCO）を使用して滅菌したPBSに交換する彼の6タグ付けされたgp120 DH12（マイケル·チョー、アイオワ州立大学からの贈り物）タンパク質バッファ。 gp120の濃度が1以上のmg / mlのないことを確認してください。注：他のX4またはR5熱帯株からの彼の6 -タグのgp120タンパク質はまた、テストされてと免疫技術から商業的に利用可能になりました。 〜pHを8.5重炭酸ナトリウムの50mMの最終濃度を取得するには、タンパク質溶液に炭酸水素ナトリウムpHが9.0を追加します。 アミン反応性のAlexa Fluor®488（AF488）ジである蛍光色素を追加10倍モル過剰で水にssolved。暗闇の中で、室温で1-2時間、この混合物をインキュベートします。 過剰な色素を除去するために、以前のように遠心フィルターユニットを使用し、カラムに新鮮な滅菌PBSを追加します。すべて無料の色素は（4 mlのPBS図3-4洗浄）が除去されるまで、この手順を繰り返します。 gp120は約1 mg / mlに濃縮されるまでスピンダウンする。注：染料は水溶性、あるいはゲルろ過を使用することができない場合透析や遠心フィルターユニットで自由に染料を削除するとのみ動作します。 標識タンパク質のタンパク質（F / P）の分子当たりの蛍光強度を測定するために、適切な波長（例えば、AlexaFluor 488用の488 nmで）および蛋白質の蛍光染料の濃度（μM）で（我々が使用するかを決定"タンパク質とラベル"設定を使用して光度計分光光度計）、次にあなたのF / P比を与え、これらの二つの数字を分割します。同じ手順は、そのようなICAM-1およびCy5のような他のタンパク質と色素のために使用されます。注：spectroph他のタイプのotometersは、光度計が使用できない場合、F / P比を得るためにタンパク質濃度と蛍光染料濃度を得るために使用することができます。 2。フローセルアセンブリと二重層の準備フローセルと二重層の準備のための一般的な手順は、以前14に詳細に記載されています。ここでは、Bioptechフローセルに彼の6タグ付けされたgp120 DH12を含む二重層を準備するために具体的にプロトコルの概要を説明します。感染性ウイルスまたは感染した細胞やときに小さなボリュームが制限された試薬のために必要なを含む研究のために、使い捨てIbidiフローチャンバー（スティッキースライドI 0.2ルアー）を使用することができ、ステップ2.4から2.9で同じ二層の準備手順に続いた。 Ibidiフローチャンバーの情報は、同社のウェブサイトから得ることができるhttp://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </>。 Pirhana液（45ミリリットル、硫酸（微量金属グレード98％）と15ミリリットルの30％過酸化水素）14を準備します 。プラスチック製のクランプで、15分間Pirhana溶液にカバーガラスを浸す。 パイカ精製した水で満たされたビーカーにカバースリップを移し、2分間（両側に各1分）の水道水でそれぞれ洗浄してください。乾燥させるラックの上に置きます。 前述の14としてBioptechs FCSII室を組み立てる。 12.5％を含有するリポソーム混合物のNi 2 +キレート脂質が16をキャプチャし、二重層の表面に彼の6-gp120を提示するために使用されています。ガラスの先端に触れることなくmicroaqueductスライド上にリポソーム混合物1μlの滴を追加します。以前に14に示すように51μlのドットがあるようにフローセルあたり5重層の最大値を準備するには、さらに4回まで繰り返します。 脂質の上にカバースリップを置きます。ステンレス鋼のclと白の保持リングをカバーアンプベースユニット、装置全体を介してシールを反転します。マーカーとの二重層の位置をマークします。室温で10分間インキュベートします。 ビデオに示すように、左の潅流チューブには2つの三方活栓とチューブを取り付けます。 50ミリリットル10倍HBS [10倍：それは上の3方活栓（チューブが以前にヒト血清アルブミン（HSA）（HBS / HSAを含むHEPES緩衝生理食塩水（HBS）で満たされているとチューブの端に正のメニスカスを生成します。 HEPES緩衝生理食塩水：200 mMのHEPES、pHは7.2、1.37 MのNaCl、50mMのKCl、7 mMののNa 2 HPO 4、60mMのD-グルコース] 20ミリリットル25倍のHSA、500μlの1M CaCl 2を 、1 mlの1 M MgCl 2をとdHは500ミリリットルと0.22μmフィルターとフィルター）への総体積をもたらすために2 0、気泡を欠いている。右灌流管にチューブを接続し、静かにフローセルを通過バッファを押してください。 1 mlの注射器を充填し、3方活栓の開口部に取り付けることにより、100μMNiCl 2を含有するカゼインの〜300μlで二重層をブロックします。ジェンTLYバッファを介してプッシュするとシリンジを離脱する前に両方のコックを閉じます。室温で30分間インキュベートします。 彼の6 -タグ（16で前述したように濃度が決定されます）gp120をAF488標識を追加します。我々はHIV-1ビリオンの表面17に見つかったenvをクラスターの局所的な密度を模倣するgp120/μm2〜250の分子を使用しています。同様に、我々は以前に報告された14として二重にICAM-1の約250分子/μm2で使用します 。カゼインで行わとして、フローセル内にロードします。室温で暗所で30分（ホイルでカバー）インキュベートします。同じ手順は、そのような彼の12タグの付いた二重層の上にICAM-1をCy5標識のような他のタンパク質を組み込むために使用されます。 バッファーの5mlで二重層を洗ってください。 3。 FRAPを経由して二重層の品質管理二重層中のタンパク質は、横方向に拡散しなければなりません。二重層の上にセルを追加する前に、それは保証することが重要である準備された二重層中のタンパク質の移動度。ここでは、最も客観的に手動で実行することができる退色後蛍光回復（FRAP）法3を説明する全反射、広視野落射蛍光、または共焦点顕微鏡を走査型レーザが点灯。目標は、漂白剤のスポットを、脂質二重層における蛍光の画像を完全に均一なフィールドになり、漂白された領域に消されていない分子の復帰を監視します。 2分で50％の回収率は許容できるかもしれません。すべての主要な顕微鏡メーカー（ライカ、ニコン、オリンパス、ツァイス）は、このアプリケーションにうまく客観照明TIRFシステムを販売しています。各企業が全反射照明やその他の動作機能のバリエーションを提供していますが、画質は基本的に同じです。 漂白最小限に抑えるために低い励起強度を使用しています。そのようなNA 1.3から1.45まで40倍、60倍または100倍などの高開口数対物を使用しています。光intensを減らすために、標準的な蛍光灯または全反射顕微鏡を使用している場合ITYは、励起光パス内のNDフィルターを入れた。ほとんどのレーザー·システムは、低電圧でacusto光波長可変フィルタ（AOTF）またはacusto光ビームスプリッタ（AOBS）を設定することにより、低照度に設定することができます。 "プレ漂白剤"のイメージを記録します。ビニングが高い、または長時間露光（秒のオーダーのインスタンスのために）設定することができます2×2のまたは4×4、ゲインに設定することができ、低照度の条件を補うために、冷却CCDカメラを使用している場合は、使用することができます。共焦点顕微鏡を使用している場合は、ピンホール開口を開くことができます。ゲインが高く設定し、低速スキャン、または使用の平均。 漂白剤のスポット。標準的な蛍光または全反射顕微鏡を使用している場合は、最大強度の照明を可能にするためにすべてのNDフィルターを削除するには、視野絞りを閉じ、数秒間のサンプルを公開します。共焦点レーザー走査型を使用している場合は、レーザパワーの最大値とズーム漂白スポットへの8倍速までの約4倍に設定された。共焦点使用のための警告：二重層が過度によって損傷される可能性があるため、高すぎでズームはありませんsively光子を集中している。 十から十五秒間隔で、記録画像は、3.1および3.2と同様に照明や録音の設定を使用します。二から三分以内にスポットは、 "プリ漂白剤"のイメージのそれに近づいて強度を回復する必要があります。迅速なリカバリが成功した携帯電話二重層の印である。スポットが暗いままの場合はエッジがハイコントラストを保持している場合、特に、蛍光タンパク質は、脂質二重層で不動であり、実験に使用すべきではありません。 注：我々の現在の顕微鏡では、4秒未満の典型的な濃度で蛍光ICAMを漂白240μmの2の面積を持つ円形のスポットに光を641 nmで0.9 mWを提供することができます。読者は30秒未満の時間は、反復可能な方法で、このアッセイを実行するのに十分以上である漂白とHgまたはXeランプの、重要なアラインメントを見つける必要があります。また、あなたは追加のDET 3を参照するために参照することになります不振の解決策。 4。細胞と免疫染色の注入 37°C（これは約30分間のないCO 2と共に37℃のインキュベーターで行うことができます）にフローセルのウォームアップを行います。 1mlの注射器によって活性化ヒトCD4 + HBS / HSA〜400μlのT細胞（2×10 6 /フローセル）を追加します。細胞は37℃インキュベーター中で約45分間二重に接続してみましょう。 Ibidi室が使用されている場合、すべての15-20分を追加のバッファを指定します。 2％パラホルムアルデヒドを注入することにより細胞を固定し、37℃で10分間インキュベート℃を 1ミリリットル室温PBS緩衝液で3倍に洗浄します。室温で5分間0.1％トリトンX-100を注入することにより、細胞を透過。 室温PBS緩衝液の1ミリリットル（リン酸化タンパク質をプロービングする際には、処理中にリン酸塩の除去を防ぐために、PBSで1mMの最終濃度または他のホスファターゼ阻害剤で、バナジン酸ナトリウムを追加することができます）で3倍の洗浄。 5％のヤギ血清とカゼインを使用してブロック室温で25分。動物の血清型は、二次抗体に依存しています。 室温PBS緩衝液1mlで3倍に洗浄します。室温で1時間 – 30分間〜300μlのBuffer /フローセルに一次抗体を追加します。初期の膜近位の活性化信号を検出するために、我々は（pLck）Lckをリン酸化し、Lckの全部又はフュに特異的な抗体を使用しています。 室温PBS緩衝液1mlで3倍に洗浄します。一次抗体で行われたバッファ内の適切な蛍光標識二次抗体を追加します。我々の実験のために、私たちは568-標識ヤギ抗ウサギ二次のAlexa Fluor®を使用しています。室温で20分間インキュベートします。 PBS緩衝液1mlで3倍に洗浄します。 注：これは唯一の二次抗体（非一次抗体）で処理される制御二重層を持つことが不可欠である。ステップ4.1から4.5と4.6をスキップ、次のとおり、ステップ4.7に進みます。これは二次抗体の非特異的結合のレベルを決定します。あるいは、直接ラベルを使用することができますED、一次抗体。 5。全反射顕微鏡による画像取得全反射顕微鏡は、250 nmまたはガラス基板とセル界面で薄く平面に限定された蛍​​光シグナルの励起を可能にします。これは、脂質二重層から、すぐに並置細胞膜からの信号のみの画像取得を保証します。したがって、シナプスでのみ分子が結像される。 TIRF画像をセルの下部にある唯一の膜近位領域があるため、背側細胞膜に取り込ままたは再配布されるタンパク質は検出されません。その後、さらに標準的な広視野またはセルの他のボリュームに比べて蓄積またはシナプス領域におけるタンパク質の分布を決定するために共焦点顕微鏡により画像を取得することが重要かもしれません。 すべての主要な顕微鏡メーカー（ライカ、ニコン、オリンパス、ツァイス）は、このAPのために働く目的照らさTIRFシステムを販売縫。各企業が全反射照明やその他の動作機能のバリエーションを提供していますが、画質は基本的に同じです。各全反射顕微鏡は、操作するための独自の詳細を持っていますが、次の一般的な規則は、高分解能イメージングを得るために適用されます。 照明は漂白を避けるために低くする必要があります。 カメラは、線形応答を持つ必要があります。 カメラなし彩度と広いダイナミックレンジ撮像が可能でなければなりません。 すべての設定が定量的な分析のための定数を設定する必要があります。 6。データ解析 CD4 + VSでのgp120とT細胞の相互作用の結果として活性化細胞内シグナルを検討するため、全反射画像の定量的な分析は、例えば、活性化とシナプス15に採用されているLckおよびフュようにするかどうかを細胞内シグナル伝達分子を決定するために行われています。ここでは、ほとんどの画像解析に適用できる簡単な方法について説明します。ImageJはおよびMetaMorphなどのアプリケーションパッケージ。ここでは私たちの方法12には、Windows、Macintosh、およびLinux上で動作するImageJを、使用しています。 分析 > セットの測定]タブで 、 エリアのチェックボックスをオンにし、 灰色の値を意味します 。あなたがポリゴンまたはフリーハンドトレース閉じた図形である画像上の関心領域を作成し、> 測定を分析しない場合、ソフトウェアは、結果表で、この測定からデータを配置します。エリアは、ピクセル数でまたはμm2となります。平均値は任意の単位での平均強度である。それから減算バックグラウンド強度を持っている必要があります。地域によっては平均マイナス背景を乗算すると、任意の単位で、タンパク質の積分強度を返します。 平均とエリアするための測定値を設定します。 一つの実験条件の画像を開きます。 各セルの、トレース、および関心領域（平均）を測定し、関心領域（背景）の外側の領域をトレースし、測定します。 1実験条件、いずれかのコピーの測定で行われ、Excelや他のスプレッドシートプログラムに貼り付けまたは測定値を保存するとき。 各実験条件6.2の手順に戻ります。 測定が完了したら、結果を計算します。式は、次のとおりです。 平均強度=の意味は – 背景を積分強度=平均強度*エリア 7。代表的な結果 VSでのgp120との相互作用の結果として初期の膜近位シグナル伝達Lckが分子およびFynの活性化と人材を測定するには、初代ヒトCD4 + T細胞は、gp120およびICAM-1 15を有する二層に導入されました。唯一のICAM-1との二重層に導入した細胞は、シグナル伝達の基礎レベルを定義するには、コントロールを務めていました。 SPEcific蛍光強度は、gp120およびICAM-1を含む積層膜上およびICAM-1の二重層と相互作用する細胞のための全体の接触面積内の細胞のためにgp120の接触領域内に測定した。平均蛍光強度の増加は、拡張の符号募集とVSのシグナル伝達分子の活性化である。これがさらに統合された蛍光強度に匹敵する増加によって実証される。しかし、統合された蛍光強度の変化がない場合は、このシグナル伝達分子の再分配を示しています。 細胞は、gp120およびICAM-1、Lckが合計とpLck（Y394）を含む脂質二重層と相互作用した後にVSインターフェイスに採用したgp120（図1＆2）と共局在した。全体の平均強度LCK（図1）は単独でICAM-1よりもgp120およびICAM-1の両方を含む二重層上に高かったが、統合された強度レベル（図1）は、Lckをに再配布されていることを示唆し、同様であったCD4 + T細胞のgp120への結合時に中央のクラスタ。しかし、pLck（Y394）（図2）の定量は、gp120およびICAM-1を含有する脂質二重層の平均強度はICAM-1単独で脂質二重層でそれより高かったことを示し、積分強度は、gp120およびICAMの両方を持つ重層に高かったICAM-1単独で脂質二重層よりも-1を返します。これは、界面でのLckが全体のレベルはgp120およびICAM-1およびICAM-1単独重層、Lckの活性化ループの残基Y394のgp120結合リン酸化の増加に付着した細胞に類似している間、あることを示しています。もっとフュはgp120およびICAM-1の両方を含む二重層よりもICAM-1単独膜上の細胞の接触面積で存在していたとは対照的に、Fynは、（図3）VSに動員されていませんでした。従って、我々はフュン島ではなく、Lckを、HIV-1 gp120の誘発VSのアクティブなキナーゼであると結論付けている。 図：HIV-1 gp120の誘起VSでの膜近位のシグナル。上の代表的な細胞の画像gp120の+ I​​CAM-1二重層（上パネル）およびICAM-1の二重層（下部パネル）が表示されます。図1の黄色の線でマークされた地域によって示されるように個々の細胞の蛍光強度は、細胞の足跡を手動でトレースする領域内に定量した。全反射顕微鏡によって検出された平均値と積分強度の定量は、それぞれ左と右のグラフに示されています。 30から350セルの合計は、各条件について定量した。バーは=5μmである。 3反復の実験のいずれかからデータが表示されます。 図1：CD4 + T細胞は、45分間だけでgp120およびICAM-1やICAM-1を含む二重層に導入し、固定されており、Lckの合計で染色した。 図2：CD4 + T細胞が重層に導入されましたsは45分間だけでgp120およびICAM-1やICAM-1を含有し、その後pLck（Y394）に固定し、染色した。 図3 CD4 + T細胞は、45分間だけでgp120およびICAM-1やICAM-1を含む二重層に導入し、固定されており、合計フュン島のために染色した。