Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

1. Маркировка gp120 Флуоресцентные красители, используемые в настоящем протоколе эффективны для связывания с белками, достаточно фото-стабильной для микроскопии изображений, и соответствовать длине волны возбуждения лазеров доступно нашим микроскопом. Эти три критерия должны быть соблюдены при выборе флуоресцентных молекул для мечения белков. Его бирже 6-меченый gp120 DH12 (подарок от д-р Майкл Чоу, Университет штата Айова) белка буфером для стерильной PBS помощью центробежного фильтра (30 кДа MWCO). Убедитесь, что gp120 концентрации не более 1 мг / мл. Примечание: Его 6-меченый gp120 белки из других X4 и R5 тропических штаммов были также испытаны и сейчас коммерчески доступны от иммунной технологий. Добавить бикарбоната натрия рН 9,0 к раствору белка для получения конечной концентрации 50 мМ бикарбоната натрия с ~ рН 8,5. Добавить амин реактивной Alexa Fluor 488 (AF488) флуоресцентного красителя, который является ди-ssolved в воде при 10-кратном молярном избытке. Выдержите эту смесь в течение 1-2 часов при комнатной температуре в темноте. Для удаления избытка красителя используется центробежный фильтр, как до, так и добавить свежие стерильной PBS к колонке. Повторите этот шаг, пока все свободное краска удаляется (3-4 промывок 4 мл PBS). Спином вниз до gp120 сосредоточено около 1 мг / мл. Примечание: Удаление свободного красителя путем диализа или центробежный фильтр работает, только если краситель растворяется в воде, либо гель-фильтрации может быть использован. Для измерения интенсивности флуоресценции в молекуле белка (F / P) меченых белков, определения концентраций (в мкМ) флуоресцентного красителя на соответствующей длине волны (например, при 488 нм для AlexaFluor 488) и белка (мы используем NanoDrop спектрофотометр с помощью "белков и этикеток настройки), а затем разделить эти два числа, давая вам F / P соотношение. Такая же процедура используется для других белков и красителей, таких как ICAM-1 и Cy5. Примечание: Другие виды spectrophotometers может быть использован для получения концентрации белка и концентрация флуоресцентного красителя для получения F / P соотношение, если NanoDrop недоступна. 2. Поток Ассамблеи клеток и Bilayer подготовка Общая процедура для сотовых потока и двухслойных Препарат был подробно описан ранее 14. Здесь мы приводим в частности, протокол подготовить бислоев содержащие его 6-меченый gp120 DH12 по мобильному поток Bioptech. Для исследований с участием инфекционных вирусов и инфицированных клеток и при небольших объемах необходимо в связи с ограниченным реактивы, одноразовые поток Ibidi камеры (липкий Слайд I 0,2 Луер) может быть использован и с той же двухслойные подготовке процедуры шаги 2.4-2.9. Информация для камер Ibidi поток может быть получена с сайта компании, http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </>. Подготовить Pirhana раствора (45 мл серной кислоты (Trace металлов класса 98%) и 15 мл 30% перекиси водорода) 14. С пластиковыми зажимами, погрузить крышки скользит в решении Pirhana в течение 15 минут. Передача охватывает скользит в стакан заполнен пика-очищенной воды и мыть каждый под проточной водой в течение 2 минут (одна минута на каждой стороне). Место на стойке, чтобы высохнуть. Соберите Bioptechs FCSII камеры, как описано выше 14. Липосомы смеси, содержащей 12,5% Ni 2 + хелатирующие липиды используются для сбора и представления его 6-gp120 на поверхности бислоя 16. Добавить 1 мкл капель смеси липосом на microaqueduct слайд, не касаясь кончика к стеклу. Чтобы подготовить максимум 5 бислоев в проточной ячейке, повторите до 4 раз больше, так что есть пять точек, 1 мкл, как показано выше 14. Поместите крышку скольжения в верхней части липидов. Накройте белым стопорное кольцо из нержавеющей стали CLусилитель базового блока, перевернуть весь аппарат снова и запечатать. Отметьте расположение бислоев с маркером. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре. Прикрепите трубку с двухсторонним кран на трубе левой перфузии, как показано на видео. Создание положительного мениска в конце трубы с 3-х ходовой кран на нем (трубка была заполнена ранее HEPES-солевой буфер (ОБД), содержащий человеческий сывороточный альбумин (HSA) (ОБД / HSA: 50 мл 10 раз HBS [10x HEPES буферный раствор: 200 мм HEPES, рН 7,2, 1,37 М NaCl, 50 мМ KCl, 7 мМ Na 2 HPO 4, 60 мМ D-глюкозы] 20 мл 25x HSA, 500 мкл 1М CaCl 2, 1 мл 1 М MgCl 2 и дН 2 0 довести общий объем до 500 мл и фильтр с 0.22μm фильтр) и лишена пузыри. Подключите трубку в правой трубе перфузии и аккуратно вставьте буфера через проточную ячейку. Блок бислоя с ~ 300 мкл казеин, содержащий 100 мкм NiCl 2, заполняя 1 мл шприц и присоединение к открытой части 3-ходовой кран. GenTLY нажмите буфер до конца и закрыть оба кранов до разъединения шприц. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре. Добавить Его 6-меченый AF488-меченных gp120 (концентрация определяется как описано выше в 16). Мы используем ~ 250 молекул gp120/μm 2 имитировать локальная плотность окр кластеров находится на ВИЧ-1 вириона поверхность 17. Кроме того, мы используем около 250 молекул / мкм 2 ICAM-1 на двухслойной как сообщалось ранее 14. Загрузить в проточной ячейки, как это сделано с казеина. Выдержите в течение 30 минут в темном (накрыть фольгой) при комнатной температуре. Такая же процедура используется для включения других белков, таких как его 12-меченый Cy5-меченных ICAM-1 на бислоя. Вымойте бислоев с 5 мл буфера. 3. Контроль качества Бислои через FRAP Белки в двухслойных должно быть сбоку к диффузии. Перед добавлением клеток на бислоев, важно для обеспеченияподвижности белков в готовом бислоя. Здесь мы опишем флуоресцентная Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) метод 3, которые могут быть выполнены вручную по наиболее объективным освещение TIRF, широкий эпифлуоресцентной поле или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Цель состоит в том, чтобы изображение полностью однородных полей флуоресценции в липидный бислой, отбеливатель месте, и следить за возвращение незамороженных молекул беленой области. Возмещение 50% за 2 минуты может быть приемлемым. Все крупные производители микроскопа (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) продают цель освещенных системы TIRF, которые хорошо работают для этого приложения. Хотя каждая компания предоставляет вариации TIRF освещение и другие эксплуатационные характеристики, качество изображения, по существу, то же самое. Использование низкой интенсивности возбуждения для минимизации отбеливания. Использование высокой числовой апертурой цель таких как Н.А. 1,3 до 1,45 40x, 60x или 100x. При использовании стандартных люминесцентных или TIRF микроскоп, чтобы уменьшить свет интенсэффективностьность, поставить фильтры нейтральной плотности на пути возбуждающего света. Большинство лазерных систем может быть установлена ​​на низком освещении, установив acusto оптический настраиваемый фильтр (AOTF) или acusto оптического светоделителя (AOBS) с низким напряжением. Запись "до отбеливатель" изображение. При использовании охлаждения ПЗС-камеры, чтобы компенсировать низкий биннинга освещенности может быть установлен в 2×2 или 4×4, прирост может быть установлен высокий или длительной экспозиции (например, порядка секунды) могут быть использованы. При использовании конфокальной, отверстие диафрагмы может быть открыт, усиление высоко посаженные, и медленное сканирование или усреднения используется. Bleach месте. При использовании стандартного флуоресценции или TIRF микроскоп, удалить все ND фильтр, чтобы обеспечить максимальную освещенность, закройте области диафрагмы и выставить образец в течение нескольких секунд. При использовании лазерной сканирующей конфокальной, установить максимальную мощность лазера и увеличить примерно 4x до 8x для отбеливания месте. Предупреждение для конфокальной использования: не увеличить слишком высокой, так как двойной слой может быть поврежден чрезмернымрекурсивно сосредоточены фотонов. В десяти до пятнадцати секундным интервалом, запись изображений с использованием того же освещения и настройки записи, как в 3.1 и 3.2. В течение двух-трех минут месте должен восстановиться интенсивностью, близкой к "до-отбеливатель" изображение. Быстрое восстановление является признаком успешного мобильного бислоя. Если пятно остается темным, и, особенно, если край сохраняет высокую контрастность, флуоресцентные белки являются неподвижными в двухслойных и не должны использоваться для эксперимента. Примечание: В нашем микроскоп, мы можем поставить 0,9 мВт 641 нм, свет в круглое пятно площадью 240 мкм 2, который отбеливает люминесцентные ICAM при типичных концентрациях менее чем за 4 секунды. Читателям следует, что критическая выравнивание рт.ст. или Xe лампы с отбеливающим раза меньше, чем за 30 секунд более чем достаточно для выполнения этого теста в повторяющихся образом. Мы также хотели бы обратиться ссылаться на 3 дополнительных Detбеспокоит. 4. Инъекции клеток и иммунофлуоресценции Окрашивание Разминка проточной ячейки до 37 ° C (это может быть сделано в 37 ° C инкубатор не CO 2 примерно на 30 мин.) Добавить активированный человека CD4 + Т-клеток (2-5×10 6 / проточной ячейке) в ОБД / HSA ~ 400 мкл на 1 мл шприц. Давайте клетки прикрепляются к бислоя на ~ 45 мин в 37 ° C инкубатора. Если Ibidi камеры используются, поставка дополнительного буфера через каждые 15-20 мин. Закрепите клеток путем введения 2% параформальдегида и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° C. Вымойте 3x с 1 мл буфера PBS комнатной температуре. Permeabilize клеток путем введения 0,1% Тритон Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте 3x с 1 мл комнатной температуры PBS буфера (при зондировании для фосфорилированных белков, вы можете добавить ванадат натрия в конечной концентрации 1 мМ или другой ингибитор фосфатазы в ФБР, чтобы предотвратить удаление фосфатов в процессе обработки). Блок с помощью казеина с 5% сыворотки козьего для25 мин при комнатной температуре. Вид животного сыворотки зависит от вторичных антител. Вымойте 3x 1 мл буфера комнате температура PBS. Добавить первичных антител в ~ 300 мкл буфера / расход клетки в течение 30 мин – 1 час при комнатной температуре. Для обнаружения начальной мембраны проксимальных активации сигнала, мы используем антител, специфичных для фосфорилированных Lck (pLck), общая Lck и Фюн. Вымойте 3x 1 мл буфера комнате температура PBS. Добавить соответствующие флуоресцентно меченных вторичных антител в буфере как это было сделано с первичными антителами. Для наших экспериментов мы используем Alexa Fluor 568-меченых козьего анти-кролик вторичны. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре. Вымойте 3x 1 мл буфера PBS. Примечание: Важно, чтобы иметь контроль бислоя, что рассматривается только с вторичными антителами (без первичных антител). Выполните шаги 4.1-4.5 и пропуска 4.6, затем перейдите к шагу 4.7. Это позволит определить уровень неспецифического связывания вашего вторичными антителами. Кроме того, можно использовать непосредственно этикеткиред первичных антител. 5. Изображение приобретение микроскопии TIRF TIRF микроскопия позволяет возбуждения флуоресцентного сигнала ограничивается 250 нм или тоньше плоскости подложки стекло и сотовый интерфейс. Это гарантирует получение изображений только сигналы от липидного бислоя и от непосредственно соединенный клеточных мембран. Таким образом, только молекул в синапсах загружаются. Потому что TIRF изображений только мембраны проксимальных область в нижней части клетки, белки, которые усваиваются или распространению в спинной мембраны не будут обнаружены. Это может быть важно то, чтобы дополнительно получить изображения со стандартных широкопольных и конфокальной микроскопии для определения накопления или распределения белков в синаптической области по сравнению с другими объемами клетки. Все крупные производители микроскопа (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) продают цель освещенных системы TIRF, которые хорошо работают для такого подходаумножения. Хотя каждая компания предоставляет вариации TIRF освещение и другие эксплуатационные характеристики, качество изображения, по существу, то же самое. Каждый микроскоп TIRF имеет свои собственные данные для работы, но следующие общие правила для получения изображений с высоким разрешением. Освещение должно быть низким, чтобы избежать обесцвечивания. Камера должна иметь линейную характеристику. Камера должна быть способна изображений с широким динамическим диапазоном, без насыщения. Все параметры должны быть установлены постоянные для количественного анализа. 6. Анализ данных Для изучения внутриклеточных сигналов активирован в результате CD4 + Т-клеток, взаимодействие с gp120 в В.С., количественного анализа изображений TIRF сделаны, чтобы определить, действительно ли внутриклеточных сигнальных молекул, таких как Lck и Фюн активируются и на работу в синапс 15. Здесь мы опишем простой метод, применяемый для большинства анализа изображенийпакеты прикладных программ, таких как ImageJ и Метаморф. Мы использовали ImageJ, которая работает на Windows, Macintosh и Linux, для нашего метода здесь 12. В анализ> Вкладка Набор измерений, флажки для района и среднего серого. Когда вы делаете области интереса на тот образ, который представляет собой многоугольник или руки прослеживается закрытой форме и не анализировать> мера, программное обеспечение будет поместить данные из этого измерения в таблице результатов. Площадь будет в число пикселов или в мкм 2. Средняя средняя интенсивность в условных единицах. Он должен иметь интенсивность фона вычитается из него. Умножив среднюю минус фон область возвращается интегральной интенсивности белка в условных единицах. Установите измерения среднего и области. Открытие изображения для одной экспериментальной состоянии. Для каждой ячейки, отслеживать и измерять область интересов (в среднем), а также отслеживать и измерять области вне области интереса (фон). Когда закончите с одной экспериментальной состоянии, либо измерения скопировать и вставить в Excel или другую программу электронной таблицы или сохранить измерений. Вернитесь к пункту 6.2 для каждой экспериментальной состоянии. Когда измерения завершены, вычислить результат. Формулы: Средняя интенсивность = средняя – фон Интегральная интенсивность = Средняя площадь * интенсивность 7. Представитель Результаты Для измерения активации и набора начальной мембраны проксимальных сигнальных молекул Lck и Фюн в результате взаимодействия с gp120 в В.С., первичных человеческих CD4 + Т-клетки были введены на бислоев несущих gp120 и ICAM-1 15. Клетки представлены бислоев только с ICAM-1 служили в качестве контроля для определения базовых уровней сигнализации. Specific интенсивности флуоресценции измеряли в gp120 площадь контакта для клеток на gp120 и ICAM-1, содержащий бислоев и в течение всей площади контакта для клеток, взаимодействующих с ICAM-1 бислоя. Увеличение средней интенсивности флуоресценции является признаком расширенного набора и активацию сигнальной молекулы в VS. Это будет еще одним свидетельством сопоставимым увеличением в комплексной интенсивности флуоресценции. Если, однако, нет никаких изменений в комплексной интенсивности флуоресценции, это указывает на перераспределение сигнальной молекулы. После того как клетки взаимодействуют с бислоев содержащие gp120 и ICAM-1, всего Lck и pLck (Y394) были привлечены к интерфейсу VS и colocalized с gp120 (рис. 1 и 2). Средняя интенсивность общего Lck (рис. 1) был выше на двухслойной, содержащих как gp120 и ICAM-1 по сравнению с ICAM-1 в одиночку, но интегрированный уровни интенсивности (рис. 1) были похожи, что свидетельствует о Lck перераспределяются вцентральный кластер на CD4 + Т-клеток, связывание gp120. Тем не менее, количественное pLck (Y394) (рис. 2) показал, что средняя интенсивность на gp120 и ICAM-1, содержащий бислоев была выше, чем на ICAM-1 только бислоя, а интегральная интенсивность была выше на двухслойных и с gp120 и ICAM -1 чем на ICAM-1 только бислоя. Это означает, что в то время как уровни общего Lck на границе похожи на клетки соблюдения на gp120 и ICAM-1 и ICAM-1 только бислоев, gp120 обязательным увеличился фосфорилирование остатков Y394 в Lck активации цикла. В отличие от Фюн не на работу в VS (рис. 3), а более Фюн присутствовал в зоне контакта клеток на ICAM-1 только бислоев, чем на бислоев, содержащих как gp120 и ICAM-1. Следовательно, можно заключить, что Lck, не Фюн, является активным киназы в ВИЧ-1 gp120 вызванных VS. Цифры: Мембранная проксимальных сигнализации на ВИЧ-1 gp120 вызванных VS. Изображения представитель клеток наgp120 + ICAM-1 бислоя (верхняя панель) и ICAM-1 бислоя (нижняя панель) показаны. Интенсивности флуоресценции отдельных клеток в количественном вручную проследить областях клетки следы, как показано в регионе отмечен желтой линией на рисунке 1. Количественная оценка среднего и интегральной интенсивности обнаружены микроскопии TIRF представлена ​​в левой и правой графиков, соответственно. В общей сложности от 30 до 350 клеток количественно для каждого состояния. Бары = 5 мкм. Данные одного из трех экспериментов повторить показаны. Рисунок 1. CD4 + Т-клетки были введены на бислоев содержащие gp120 и ICAM-1 и ICAM-1 только в течение 45 минут, а затем фиксировали и окрашивали для общего Lck. Рисунок 2. CD4 + Т-клетки были введены на двухслойнойс содержащим gp120 и ICAM-1 и ICAM-1 только в течение 45 минут, а затем фиксировали и окрашивали для pLck (Y394). Рисунок 3. CD4 + Т-клетки были введены на бислоев содержащие gp120 и ICAM-1 и ICAM-1 только в течение 45 минут, а затем фиксировали и окрашивали для общего Фюн.