Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

1. Étiquetage GP120 Les colorants fluorescents utilisés dans ce protocole sont efficaces pour se lier aux protéines, sont suffisamment photo-stable pour l'imagerie microscopique, et correspondent aux longueurs d'onde d'excitation des lasers disponibles avec notre microscope. Ces trois critères doivent être respectés lors de la sélection des molécules fluorescentes pour marquage des protéines. Échange Son 6-étiquetés gp120 DH12 (un don du Dr. Michael Cho, Iowa State University) de tampon de protéines pour PBS stérile en utilisant une unité de filtre centrifuge (30 MWCO kDa). Assurez gp120 concentration n'est pas supérieure à 1 mg / ml. Note: Son 6-étiquetés protéines gp120 de l'autre X4 ou R5 souches tropicales ont également été testés et sont maintenant disponibles dans le commerce de Technologies immunitaire. Ajouter de bicarbonate de sodium pH 9,0 à votre solution de protéines pour obtenir une concentration finale 50 mM de bicarbonate de sodium avec un pH ~ 8,5. Ajouter amine réactive Alexa Fluor 488 (AF488) colorant fluorescent, qui est dissolved dans l'eau à un excès de 10 fois molaire. Incuber le mélange pendant 1-2 heures à température ambiante dans l'obscurité. Pour supprimer l'excès de colorant, d'utiliser l'unité de filtre centrifuge comme avant et ajouter de l'PBS stérile à la colonne. Répétez cette étape jusqu'à ce que toute la teinture libre est éliminé (3-4 lavages avec 4 ml de PBS). Tourner vers le bas jusqu'à la gp120 est concentré à environ 1 mg / ml. Remarque: la suppression de colorant libre par dialyse ou centrifuge unité de filtre ne fonctionne que si le colorant est soluble dans l'eau, ou encore de filtration sur gel peut être utilisé. Pour mesurer l'intensité de fluorescence par molécule de protéine (F / P) de la protéine marquée, de déterminer les concentrations (en um) de le colorant fluorescent à la longueur d'onde appropriée (par exemple, à 488 nm pour AlexaFluor 488) et des protéines (que nous utilisons un spectrophotomètre en utilisant les NanoDrop des protéines et des étiquettes de réglage), puis diviser ces deux nombres qui vous donne le rapport F / P. La même procédure est utilisée pour d'autres protéines et des colorants tels que ICAM-1 et Cy5. Remarque: D'autres types de spectrographeotometers peut être utilisé pour obtenir la concentration en protéine fluorescente et la concentration de colorant pour obtenir le rapport F / P si une NanoDrop n'est pas disponible. 2. Assemblée cellule d'écoulement et de préparation bicouche La procédure générale pour cellule d'écoulement et la préparation bicouche a été décrite en détail précédemment 14. Nous exposons ici spécifiquement le protocole pour préparer bicouches contenant Son 6-étiquetés gp120 DH12 sur une cellule d'écoulement Bioptech. Pour les études impliquant des virus infectieux ou des cellules infectées et quand de petits volumes sont nécessaires en raison de réactifs limitées, une chambre de débit jetable ibidi (Diapositive collant I 0,2 Luer) peuvent être utilisés et suivis avec la procédure de préparation bi-couche même dans les étapes 2.4-2.9. Information pour les chambres d'écoulement ibidi peuvent être obtenus auprès du site de l'entreprise, http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </a>. Préparer la solution Pirhana (45 ml d'acide sulfurique (teneur en métaux Trace 98%) et 15 ml de peroxyde d'hydrogène 30%) 14. Avec pinces en plastique, couvercle immerger glisse dans la solution Pirhana pendant 15 minutes. Transfert de couvrir les feuillets d'un bécher rempli d'eau purifiée pica-et laver chacun sous l'eau courante pendant 2 min (une minute de chaque côté). Placer sur une grille pour sécher. Assemblez Bioptechs FCSII chambres comme décrit précédemment 14. Un mélange de liposomes contenant 12,5% Ni 2 + lipides chélateurs est utilisé pour la capture et la présentation de son 6-gp120 à la surface bicouche 16. Ajouter 1 gouttes ul de mélange liposome sur la lame microaqueduct sans toucher à la pointe de la vitre. Pour préparer le maximum de 5 bicouches par cellule d'écoulement, répéter jusqu'à 4 fois plus de sorte qu'il ya cinq points 1 microlitre comme indiqué précédemment 14. Placez lamelle sur le dessus de lipides. Couvrir l'anneau blanc de retenue avec un cl en acier inoxydableunité de base ampli, retourner l'ensemble de l'appareil au cours et sceller. Marquer l'emplacement de bicouches avec un marqueur. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Fixer le tube à deux voies robinet au tube de perfusion à gauche, comme indiqué dans la vidéo. Générer un ménisque positif à la fin de la tubulure avec le robinet à 3 voies sur elle (tube a été préalablement remplie avec une solution saline tamponnée HEPES (HBS) contenant l'albumine sérique humaine (HSA) (HBS / HSA: 50 ml 10x HBS [10x HEPES une solution saline tamponnée: 200 mM d'HEPES, pH 7,2, 1,37 M de NaCl, KCl 50 mM, 7 mM de Na 2 HPO 4, 60 mM D-glucose] 20 ml 25x HSA, 500 pi 1M CaCl 2, 1 ml 1 M de MgCl 2 et dH 2 0 à mettre un volume total d') et le filtre avec 500 ml 0.22μm filtre et est dépourvu de bulles. connecter tube à tube de perfusion droite et pousser doucement tampon à travers la cellule d'écoulement. Bloquer bicouche avec ~ 300 pi de la caséine contenant 100 uM NiCl 2 en remplissant seringue de 1 ml et attacher à la partie ouverte de robinet 3 voies. GenTLY pousser tampon à travers et fermer les deux robinets d'arrêt avant de dégager la seringue. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ajouter Son 6-étiquetés AF488 marqué gp120 (la concentration est déterminée comme décrit précédemment dans 16). Nous utilisons environ 250 molécules de gp120/μm 2 à imiter la densité locale de grappes Env trouvés sur la surface du VIH-1 virion 17. De même, nous utilisons environ 250 molécules / um 2 d'ICAM-1 sur la bicouche comme indiqué précédemment 14. Chargez-les dans la cellule à flux comme on le fait avec de la caséine. Incuber pendant 30 min dans l'obscurité (recouvrir de papier) à la température ambiante. La même procédure est utilisée pour incorporer d'autres protéines telles que Son 12-étiqueté Cy5-étiquetés ICAM-1 sur la bicouche. Laver bicouches avec 5 ml de tampon. 3. Contrôle de la qualité de bicouches par FRAP Protéines dans les bicouches doivent être latéralement diffusible. Avant d'ajouter des cellules sur des bicouches, il est important d'assurer lala mobilité des protéines dans la bicouche préparée. Nous décrivons ici une récupération fluorescent Après photoblanchiment (FRAP) la méthode 3 qui peuvent être effectués manuellement sur ​​la plus objective illuminée FRBR, épifluorescence large champ, ou à balayage laser microscopes confocaux. L'objectif est de champs d'image totalement uniformes de la fluorescence dans la bicouche lipidique, l'eau de Javel une place, et de surveiller le retour des molécules inassouvis de la zone blanchie. Une reprise de 50% en 2 minutes peut être acceptable. Tous les principaux fabricants de microscopes (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) de vendre des systèmes objectifs TIRF illuminés qui fonctionnent bien pour cette application. Bien que chaque société fournit des variations d'éclairage TIRF et d'autres aspects opérationnels, la qualité d'image est essentiellement le même. Utilisez une intensité d'excitation faible pour minimiser le blanchiment. Utilisez un objectif à ouverture numérique élevée comme un NA de 1,3 à 1,45 40x, 60x ou 100x. Lors de l'utilisation d'un microscope fluorescent standard ou FRBR, afin de réduire les intens lumièrelité, mis filtres de densité neutre dans le trajet de lumière d'excitation. La plupart des systèmes laser peut être réglé pour un éclairage faible en fixant un acusto optique filtre accordable (AOTF) ou acusto diviseur de faisceau optique (AOB) en basse tension. Enregistrez un «pré-blanchiment" de l'image. Si vous utilisez une caméra CCD refroidie, pour compenser la lumière des conditions de faible binning peut être mis à 2×2 ou 4×4, le gain peut être réglé de fortes expositions, ou longs, par exemple, de l'ordre de secondes) peut être utilisé. Si vous utilisez un confocale, l'ouverture sténopé peut être ouvert; le gain attachées haut, et la numérisation lente ou moyenne utilisée. Bleach une place. Si vous utilisez une fluorescence norme ou d'un microscope TIRF, supprimer tous les filtres ND pour permettre un éclairage d'intensité maximale, fermer le diaphragme de champ, et d'exposer l'échantillon pendant quelques secondes. Si vous utilisez un balayage laser confocal, régler le maximum de puissance du laser et de zoom dans environ 4x à 8x pour blanchir un endroit. Un avertissement pour une utilisation confocale: ne pas faire un zoom avant trop élevé parce que la bicouche peut être endommagé par excèsexclusivement concentrée photons. A dix à quinze secondes d'intervalle, d'enregistrer des images en utilisant le même éclairage et les paramètres d'enregistrement comme dans 3.1 et 3.2. Dans les deux à trois minutes de la place doit permettre de récupérer l'intensité proche de celle de la "pré-blanchiment" de l'image. Une récupération rapide est le signe d'une bicouche mobile à succès. Si la tache reste sombre, et surtout si le bord conserve un contraste élevé, les protéines fluorescentes sont immobiles dans la bicouche et ne doit pas être utilisé pour l'expérience. Remarque: Dans notre microscope actuelle, nous pouvons livrer 0,9 mW de 641 nm à la lumière une tache circulaire d'une superficie de 240 um 2, qui blanchit ICAM fluorescente à des concentrations typiques en moins de 4 secondes. Les lecteurs doivent trouver que l'alignement critique d'une Hg ou Xe lampe avec blanchiment fois moins de 30 secondes est plus que suffisant pour effectuer ce test de manière reproductible. Nous aimerions également vous référer à la référence 3 pour plus de detmaux. 4. L'injection de cellules et immunofluorescence Réchauffez la cellule à flux à 37 ° C (cela peut être fait dans un incubateur à 37 ° C sans CO 2 pendant environ 30 min). Ajouter activés CD4 + humains cellules T (2-5×10 6 / flux de cellules) dans HBS / HSA ~ 400 pi par seringue de 1 ml. Laissez cellules joindre à bicouche pour ~ 45 min dans l'incubateur à 37 ° C. Si les chambres ibidi sont utilisés, fournir tampon supplémentaire toutes les 15-20 minutes. Fixer les cellules en injectant paraformaldéhyde 2% et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C. Laver 3x avec la température ambiante tampon PBS 1ml. Perméabiliser les cellules en injectant 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. Laver 3x avec 1 ml de la température ambiante du tampon PBS (durant la sonde pour des protéines phosphorylées, vous pouvez ajouter de vanadate de sodium à 1 mM concentration finale ou un autre inhibiteur de la phosphatase dans du PBS pour empêcher l'élimination du phosphate au cours du traitement). Bloquer l'utilisation de caséines avec du sérum de chèvre de 5% pour25 min à température ambiante. Le type de sérum animal dépend de la anticorps secondaire. Laver 3x avec 1 ml de la température ambiante du tampon PBS. Ajouter anticorps primaire dans ~ 300 pi de tampon / flux de cellules pendant 30 min – 1 h à température ambiante. Pour détecter le signal d'activation initiale membrane proximale, nous utilisons des anticorps spécifiques pour phosphorylée Lck (pLck), le total des Lck ou Fionie. Laver 3x avec 1 ml de la température ambiante du tampon PBS. Ajouter appropriée d'anticorps marqué par fluorescence secondaire dans un tampon comme cela se fait avec l'anticorps primaire. Pour nos expériences, nous utilisons Alexa Fluor 568-étiquetés de chèvre anti-lapin secondaire. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Laver 3x avec 1 ml de tampon PBS. Remarque: Il est essentiel d'avoir une bicouche de commande qui est traitée avec seulement anticorps secondaire (anticorps primaire ne). Suivez les étapes et sauter 4.1-4.5 4.6, puis passez à l'étape 4.7. Cela permettra de déterminer le niveau de la liaison non spécifique de votre anticorps secondaire. Alternativement, on peut utiliser directement l'étiquetteanticorps primaires éd. 5. L'acquisition des images par microscopie TIRF Microscopie TIRF permet d'excitation de signaux fluorescents limitées à une 250 nm ou plus mince planes au niveau du substrat en verre et l'interface cellulaire. Ce qui garantit l'acquisition d'images de signaux uniquement à partir de la bicouche lipidique et des membranes cellulaires immédiatement apposées. Par conséquent, seules les molécules à la synapse sont imagés. Parce que les images TIRF que la zone de membrane proximale à la partie inférieure de la cellule, les protéines qui sont internalisées ou redistribuées dans la membrane dorsale ne seront pas détectées. Il peut alors être important de en outre acquérir des images grand champ par la norme ou la microscopie confocale pour déterminer l'accumulation ou la distribution des protéines à la zone synaptique par rapport aux autres volumes de la cellule. Tous les principaux fabricants de microscopes (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) de vendre des systèmes objectifs TIRF illuminés qui fonctionnent bien pour ce point d'accèscation. Bien que chaque société fournit des variations d'éclairage TIRF et d'autres aspects opérationnels, la qualité d'image est essentiellement le même. Chaque microscope TIRF a ses propres détails pour le fonctionnement, mais les règles générales suivantes s'appliquent pour obtenir des images haute résolution. Éclairage doit être faible pour éviter le blanchiment. La caméra doit avoir une réponse linéaire. La caméra devrait être capable d'imagerie d'une large gamme dynamique sans aucune saturation. Tous les paramètres doivent être constants pour les analyses quantitatives. 6. Analyse des données Pour étudier les signaux intracellulaires activées à la suite de l'interaction CD4 + lymphocytes T avec la gp120 à la VS, des analyses quantitatives des images TIRF sont effectués pour déterminer si oui ou non molécules de signalisation intracellulaires tels que Lck et Fyn sont activés et recrutés pour la synapse 15. Nous décrivons ici une méthode simple applicable à la plupart des analyses d'imagedes packages d'applications telles que ImageJ et Metamorph. Nous avons utilisé ImageJ, qui fonctionne sur Windows, Macintosh, et ​​Linux, pour notre méthode ici 12. Dans le Analyser Set Mesures> onglet, cocher les cases pour la zone et la valeur moyenne de gris. Lorsque vous effectuez une région d'intérêt sur ​​l'image qui est un polygone à main levée ou d'un tracé de forme fermée et ne Analyser> Mesure, le logiciel va mettre les données de cette mesure dans un tableau de résultats. La zone sera en nombre de pixels ou en 2 microns. La moyenne est de l'intensité moyenne en unités arbitraires. Il doit avoir une intensité de fond soustrait. Multipliant le fond moyenne moins par zone renvoie l'intensité intégrée de la protéine en unités arbitraires. Définissez les mesures à moyen et de la région. Ouvrez les images pour une condition expérimentale. Pour chaque cellule, de tracer et de mesurer la région d'intérêt (moyenne) et de tracer et de mesurer une région en dehors de la région d'intérêt (de fond). Lorsque vous avez terminé avec une condition expérimentale, les mesures copie soit et collez-le dans Excel ou autre tableur ou d'enregistrer les mesures. Revenir à l'étape 6.2 pour chaque condition expérimentale. Lorsque les mesures sont terminées, le calcul des résultats. Les formules sont les suivantes: Intensité moyenne = moyenne – de fond Intensité intégrée = Superficie moyenne intensité * 7. Les résultats représentatifs Pour mesurer l'activation et le recrutement des premiers membrane proximal molécules de signalisation LCK et Fyn comme un résultat de l'interaction avec la gp120 à la VS, primaires CD4 + humains cellules T ont été introduits dans les bicouches portant gp120 et ICAM-1 15. Les cellules introduites à bicouches avec seulement ICAM-1 a servi de témoin pour définir les niveaux de base de la signalisation. Spespécifique intensité de fluorescence est mesurée dans la zone de contact pour la gp120 cellules sur la gp120 et ICAM-1 bicouches contenant et dans la zone de contact pour l'ensemble des cellules qui interagissent avec l'ICAM-1 bicouche. Une augmentation de l'intensité de fluorescence moyenne est un signe de augmentée recrutement et l'activation de la molécule de signalisation de la VS. Ce sera également démontrée par une augmentation comparable de l'intensité de fluorescence intégré. Si toutefois, il n'ya pas de changement dans l'intensité de fluorescence intégré, ce qui indique une redistribution de la molécule de signalisation. Après que les cellules contenant des bicouches interagi avec la gp120 et ICAM-1, le total des Lck et pLck (Y394) ont été recrutés à l'interface VS et colocalisés avec la gp120 (fig. 1 & 2). L'intensité moyenne du total des Lck (Fig. 1) était plus élevée sur la bicouche contenant à la fois la gp120 et ICAM-1 qu'avec ICAM-1 seul, mais les niveaux d'intensité intégrés (Fig. 1) étaient similaires, ce qui suggère que Lck est redistribué dansun cluster central sur cellules T CD4 + se liant à gp120. Cependant, la quantification des pLck (Y394) (Fig. 2) montre que l'intensité moyenne sur la gp120 et ICAM-1 bicouches contenant était plus élevé que celui d'ICAM-1 bicouches seuls, et l'intensité intégrée était plus élevée sur les bicouches avec deux gp120 et ICAM -1 que sur ICAM-1 bicouches seuls. Cela indique que même si les niveaux du total LCK à l'interface sont similaires dans les cellules adhérant à la gp120 et ICAM-1 et ICAM-1 bicouches seuls, gp120 phosphorylation de liaison accrue des résidus Y394 à la boucle d'activation Lck. En revanche, Fionie n'a pas été recruté au VS (Fig. 3), comme plus Fionie était présent dans la zone de contact des cellules sur ICAM-1 bicouches seuls que sur bicouches contenant à la fois la gp120 et ICAM-1. Par conséquent, nous concluons que Lck, Fyn pas, est la kinase active à la gp120 du VIH-1 induite par VS. Les chiffres: Membrane-proximale de signalisation à VIH-1 gp120 induit VS. Images de cellules représentatives sur legp120 + ICAM-1 bicouche (panneaux supérieurs) et d'ICAM-1 bicouche (panneaux inférieurs) sont présentés. Intensités de fluorescence des cellules individuelles ont été quantifiés dans les zones tracées manuellement des empreintes de cellules comme illustré par la région marquée avec la ligne jaune dans la figure 1. Quantification des intensités moyennes et intégrée détectée par microscopie TIRF sont présentés dans le graphique de gauche et de droite, respectivement. Un total de 30 à 350 cellules ont été quantifiés pour chaque condition. Bars = 5 um. Les données de l'une des trois expériences répétées sont présentés. CD4 Figure 1. + De lymphocytes T ont été introduits dans les bicouches contenant gp120 et ICAM-1 ou ICAM-1 seul pendant 45 min puis fixées et colorées pour un total Lck. CD4 Figure 2. + De lymphocytes T ont été introduits dans bicouches contenant la gp120 et ICAM-1 ou ICAM-1 seul pendant 45 min puis fixées et colorées pour pLck (Y394). CD4 Figure 3. + De lymphocytes T ont été introduits dans les bicouches contenant gp120 et ICAM-1 ou ICAM-1 seul pendant 45 min puis fixées et colorées pour Fionie totale.