التصوير من HIV-1 مغلف من صنع المشبك الفيروسية، واشارة على طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية
1Department of Pathology,New York University Langone School of Medicine, 2Program in Molecular Pathogenesis,Marty and Helen Kimmel Center for Biology and Medicine and Skirball Institute for Biomolecular Medicine, 3Laboratory of Molecular Immunogenetics, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases,National Institutes of Health, 4Veteran Affairs New York Harbor Healthcare System
Summary
توضح هذه المقالة طريقة لتصور تشكيل المشبك 1 الفيروسية HIV-1 مغلف الناجم عن طبقات ثنائية الزجاج مستو بدعم من مجموع المجهري التأمل الداخلي (TIRF) مضان. ويمكن أيضا أن تكون مجتمعة مع طريقة تلوين المناعي للكشف عن تنشيط وإعادة توزيع الجزيئات مما يشير إلى أن تحدث أثناء-1 فيروس نقص المناعة البشرية مغلف التي يسببها تشكيل المشبك الفيروسية.
Abstract
نوع فيروس نقص المناعة البشري 1 (HIV-1) تحدث العدوى بأكبر قدر من الكفاءة عن طريق خلية إلى خلية انتقال 2،10،11. هذه الخلية لنقل الخلية بين خلايا CD4 + T ينطوي على تشكيل المشبك الفيروسية (ص)، وهي من طراز F-الأكتين التي تعتمد على خلية خلية تقاطع شكلت بناء على إشراك HIV-1 مغلف gp120 على الخلية المصابة مع وCD4 مستقبلات chemokine (CKR) CCR5 أو CXCR4 على الخلية الهدف 8. بالإضافة إلى gp120 ومستقبلات لها، بروتينات غشاء الأخرى، ولا سيما جزيء التصاق LFA-1 و يغاندس لها، والأسرة ICAM، تلعب دورا رئيسيا في تشكيل VS وانتقال الفيروس كما هي موجودة على سطح الخلايا المصابة بالفيروسات من الجهات المانحة الخلايا المستهدفة، وكذلك على المغلف من virions-1 فيروس نقص المناعة البشرية 1،4،5،6،7،13. ويرافق أيضا VS تشكيل بواسطة الخلايا الأحداث يشير إلى أن يتم transduced نتيجة الاشتباك، gp120 من المستقبلات لها. في الواقع، لقد أظهرت مؤخرا أن CD4 <سوب> + تفاعل الخلايا التائية مع gp120 يدفع التوظيف والفسفرة من الجزيئات مما يشير المرتبطة signalosome TCR بما في ذلك LCK، CD3ζ، ZAP70، LAT، SLP-76، Itk، و 15 PLCγ.
في هذه المقالة، نقدم طريقة لتصور ترتيب supramolecular والأحداث يشير الأغشية القريبة تحدث خلال تشكيل VS. علينا أن نستفيد من نظام الزجاج المدعومة من ثنائي طبقة مستو كنموذج الاختزالية لتمثيل سطح الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية تحمل المغلف الفيروسية gp120 وجزيء التصاق الخلوية ICAM-1. بروتوكول يصف الإجراءات العامة لرصد HIV-1 gp120 التي يسببها VS التجمع وأحداث التنشيط التي تتضمن إشارة ط) ثنائي الطبقة إعداد والتجمع في خلية تدفق، الثاني) حقن الخلايا وتلطيخ المناعي للكشف عن الخلايا الجزيئات مما يشير على الخلايا تتفاعل مع اكتساب-1 فيروس نقص المناعة البشرية صورة gp120 وICAM-1 على ثنائي الطبقات، والثالث) بواسطة المجهر TIRF، وهوالثانية والرابعة) وتحليل البيانات. هذا النظام يولد صورا عالية الدقة من واجهة VS أبعد من ذلك يتحقق مع نظام خلية خلية التقليدية لأنها تتيح الكشف عن مجموعات متميزة من المكونات الجزيئية الفردية VS جنبا إلى جنب مع جزيئات إشارة محددة إلى توظيف هذه المجالات الفرعية.
Protocol
1. وصفها GP120 الأصباغ الفلورية المستخدمة في هذا البروتوكول لا تكون فعالة للربط إلى البروتينات، بما فيه الكفاية الصور ومستقر للتصوير المجهري، وتتطابق مع موجات الإثارة ليزر المتاحة مع المجهر لدينا. هذه المعايير الثلاثة يجب أن تتحقق عند اختيار جزيئات البروتينات الفلورية للعلامات. تبادل صاحب 6 الموسومة gp120 DH12 (هدية من الدكتور مايكل تشو، جامعة ولاية ايوا) العازلة البروتين لبرنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام وحدة الطرد المركزي فلتر (30 MWCO قده). تأكد gp120 تركيز ليست أكثر من 1 ملغ / مل. ملاحظة: صاحب 6 الموسومة gp120 البروتينات من X4 أو غيرها من سلالات R5 مدار كما تم اختبارها وأصبحت الآن متاحة تجاريا من تقنيات المناعي. إضافة بيكربونات الصوديوم 9.0 درجة الحموضة إلى حل البروتين الخاص بك للحصول على تركيز نهائي 50mM من بيكربونات الصوديوم مع درجة الحموضة ~ 8.5. إضافة أمين رد الفعل اليكسا فلور 488 (AF488) صبغة الفلورسنت، التي هي ديssolved في الماء في زيادة بمقدار 10 أضعاف الرحى. احتضان هذا الخليط لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لإزالة الصبغة الزائدة، واستخدام وحدة الطرد المركزي مرشح كما كان من قبل وإضافة جديدة معقمة PBS إلى العمود. كرر هذه الخطوة حتى يتم إزالة جميع صبغ الحرة (يغسل 3-4 مع PBS مل 4). تدور أسفل حتى يتركز gp120 إلى حوالي 1 ملغ / مل. ملاحظة: إزالة الصبغة مجانا من وحدة غسيل الكلى أو فلتر الطرد المركزي تعمل إلا إذا كان هو صبغ للذوبان في الماء، وإلا يمكن استخدام هلام الترشيح. لقياس كثافة مضان في جزيء من البروتين (F / P) من البروتين المسمى، وتحديد تراكيز (في ميكرومتر) من صبغة الفلورسنت في الطول الموجي المناسب (على سبيل المثال، في 488 نانومتر لAlexaFluor 488) والبروتين (التي نستخدمها 1 معمل NanoDrop باستخدام 'البروتينات وتسميات' الإعداد) ومن ثم تقسيم هذين الرقمين مما يتيح لك نسبة F / P. يتم استخدام نفس الإجراء البروتينات وغيرها من الأصباغ مثل ICAM-1 و Cy5. ملاحظة: هناك أنواع أخرى من spectrophويمكن استخدام otometers للحصول على تركيز البروتين وتركيز صبغة الفلورسنت للحصول على نسبة F / P إذا كان NanoDrop غير متوفر. 2. تدفق الجمعية الخلية، وإعداد طبقة ثنائية وقد وصفت هذا الإجراء العام لخلية تدفق وإعداد طبقة ثنائية بالتفصيل 14 سابقا. نحن هنا الخطوط العريضة على وجه التحديد لإعداد بروتوكول طبقات ثنائية تحتوي على صاحب 6 الموسومة gp120 DH12 على خلية تدفق Bioptech. يمكن أن تستخدم في الدراسات التي تنطوي على الفيروسات المعدية أو الخلايا المصابة وعندما كميات صغيرة ضرورية بسبب الكواشف محدودة وتدفق Ibidi المتاح غرفة (الشرائح زجة أنا Luer 0،2)، ويتبع نفس الإجراء مع إعداد ثنائي الطبقة في خطوات 2،4-2،9. ويمكن الحصول على معلومات عن غرف تدفق Ibidi من موقع الشركة، http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </أ>. إعداد Pirhana حل (45 مل حامض الكبريتيك (تتبع الصف المعادن 98٪) و 15 بيروكسيد الهيدروجين مل 30٪) 14. مع المشابك البلاستيكية، وغطاء غمر ينزلق في حل Pirhana لمدة 15 دقيقة. نقل تغطية زلات لكوب مملوء بيكا-تنقية المياه وغسل كل واحد تحت الماء الجاري لمدة 2 دقيقة (دقيقة واحدة على كل جانب). مكان على الرف حتى يجف. التجمع Bioptechs FCSII غرف كما هو موضح سابقا 14. مزيج الحويصلية التي تحتوي على 12.5٪ ني 2 + يستخدم الدهون شيلاتينغ لالتقاط وعرض له 6-gp120 على السطح طبقة ثنائية 16. إضافة 1 قطرات ميكرولتر من خليط الحويصلية على الشريحة microaqueduct دون لمس طرف على الزجاج. لإعداد الحد الأقصى من 5 طبقات ثنائية لكل خلية تدفق، وتكرار ما يصل الى 4 مرات أكثر بحيث هناك خمس نقاط 1μl كما هو موضح سابقا 14. وضع غطاء على رأس زلة من الدهون. تغطية حلقة بيضاء مع الإبقاء على البنود الفولاذ المقاوم للصدأأمبير وحدة قاعدة، والوجه الجهاز كله على والختم. بمناسبة موقع من طبقات ثنائية مع علامة. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نعلق أنبوب مع اتجاهين محبس إلى أنبوب نضح اليسار، كما هو موضح في الفيديو. إنشاء الغضروف المفصلي إيجابي في نهاية الأنبوب مع محبس 3 في اتجاه وعلى ذلك (وقد تم شغلها سابقا مع أنابيب HEPES مخزنة المالحة (HBS) التي تحتوي على مصل الإنسان (HSA) (HBS / هائل سعيد أنعم: 50 HBS مل 10X [10X مخزنة HEPES المالحة: HEPES 200 مم، ودرجة الحموضة 7.2، 1.37 M كلوريد الصوديوم، 50 ملي بوكل، 7 مم نا 2 هبو 4، 60 مم D-جلوكوز] 20 HSA مل 25x، 500 CaCl 1M ميكرولتر 2، 1 مل 1 م 2 و MgCl DH 2 0 لتحقيق الحجم الكلي ل) 500ml وفلتر مع فلتر 0.22μm وخال من الفقاعات. توصيل أنبوب إلى أنبوب نضح الحق ودفع بلطف العازلة من خلال خلية تدفق. منع طبقة ثنائية مع ميكرولتر 300 ~ من الكازين التي تحتوي على 100 ميكرون NiCl 2 عن طريق ملء محقنة 1 مل والمترتبة على جزء مفتوح من 3 في اتجاه ومحبس. الجنرالدفع tly العازلة من خلال وإغلاق الصمامات على حد سواء قبل فك الارتباط بين حقنة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة gp120 له 6-الموسومة AF488 المسمى (يتم تحديد تركيز كما هو موضح سابقا في 16). نحن نستخدم ~ 250 الجزيئات من gp120/μm 2 إلى محاكاة كثافة المحلية للتجمعات الليلية وجدت على سطح الفيريون HIV-1 17. وبالمثل، ونحن نستخدم ~ 250 الجزيئات / ميكرون 2 من ICAM-1 على طبقة ثنائية كما ذكرت سابقا 14. تحميل إلى خلية تدفق كما فعلت مع الكازين. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام (مع تغطية احباط) في درجة حرارة الغرفة. يتم استخدام نفس الإجراء لإدراج البروتينات الأخرى مثل صاحب 12-الموسومة Cy5 المسمى ICAM-1 على طبقة ثنائية. غسل طبقات ثنائية مع 5 مل من العازلة. 3. مراقبة الجودة من طبقات ثنائية عبر FRAP يجب أن تكون البروتينات في طبقات ثنائية إنتشاري أفقيا. قبل أن يضيف الخلايا على طبقات ثنائية، من المهم أن أؤكد للالتنقل من البروتينات في طبقة ثنائية المعدة. نحن هنا وصف انتعاش نيون بعد Photobleaching (FRAP) الأسلوب 3 التي يمكن القيام بها يدويا على معظم هدف TIRF مضيئة، واسعة epifluorescence الميدان، أو ليزر متحد البؤر المسح المجاهر. والهدف من ذلك هو حقول صورة موحدة تماما من التألق في طبقة ثنائية المادة الدهنية، تبييض بقعة، ورصد عودة جزيئات unquenched إلى المنطقة المبيض. ويجوز للانتعاش من 50٪ في 2 دقيقة تكون مقبولة. جميع الشركات المصنعة للمجهر الرئيسية (لايكا، نيكون، أوليمبوس، زايس) هدف بيع أنظمة TIRF المضيئة التي تعمل بشكل جيد لهذا التطبيق. في حين تقدم الشركة كل أشكال مختلفة من الإضاءة TIRF والميزات التشغيلية الأخرى، جودة الصورة هو في الأساس نفسه. استخدام شدة الإثارة منخفضة للحد من تبييض. استخدام عالية هدف الفتحة العددية مثل 1،3-1،45 NA 60x، 40X أو 100X. عند استخدام المجهر الفلورسنت القياسية أو TIRF، للحد من intens ضوءإيتي، وطرح مرشحات الكثافة محايدة في إثارة مسار الضوء. قد يتم تعيين معظم أنظمة ليزر لإضاءة منخفضة من خلال وضع بصري acusto الانضباطي فلتر (AOTF) أو acusto بصري شعاع الخائن (AOBS) مع الجهد المنخفض. تسجيل "ما قبل التبييض" صورة. إذا قد يتم تعيين باستخدام كاميرا CCD المبردة، للتعويض عن انخفاض ضوء الظروف binning إلى 2X2 أو 4X4، قد يتم تعيين كسب التعرض عالية، أو طويلة (على سبيل المثال بناء على أمر من ثانية) يمكن استخدامها. إذا باستخدام مبائر، قد يتم فتح فتحة الثقب، وتحقيق مكاسب عالية، والمسح الضوئي البطيء أو المتوسط المستخدمة. تبييض بقعة. إذا باستخدام معيار أو مضان المجهر TIRF، وإزالة جميع المرشحات ND للسماح للإضاءة شدة أقصى، إغلاق الحاجز الميدان، وفضح عينة لبضع ثوان. إذا باستخدام ليزر متحد البؤر المسح الضوئي، تعيين الحد الأقصى لقوة الليزر وتكبير 4X 8X تقريبا لتبييض بقعة. تحذير للاستخدام مبائر: لا تكبير عالية جدا لأنه قد يكون معطوبا طبقة ثنائية بواسطة excesتتركز sively الفوتونات. في 10-15 فترات الثانية، سجل الصور باستخدام الإضاءة وإعدادات التسجيل كما هو الحال في 3.1 و 3.2. في غضون سنتين إلى ثلاث دقائق وينبغي على الفور استعادة كثافة التي تقترب من الصورة "قبل التبييض". انتعاش سريع هو علامة على طبقة ثنائية المحمول ناجحة. إذا كان لا يزال بقعة مظلمة، وخاصة إذا كان على حافة يحتفظ التباين العالي، والبروتينات الفلورية غير قادرة على الحركة في طبقة ثنائية ويجب أن لا تستخدم للتجربة. ملاحظة: في مجهر حالتنا الراهنة، ما يمكن ان نقدمه 0،9 ميغاواط من ضوء نانومتر من 641 إلى بقعة دائرية على مساحة من 240 ميكرومتر (2) الذي التبييض ICAM فلوري بتركيزات نموذجي في أقل من 4 ثوان. وينبغي أن يجد القراء أن المحاذاة الحرجة من الزئبق أو مصباح اكس مع تبيض مرات أقل من 30 ثانية هي أكثر من كافية لأداء هذا الاختبار بطريقة قابلة للتكرار. نود أن نشير أيضا إلى مرجع لك 3 لديت إضافيةتعانيه. 4. حقن الخلايا وتلطيخ المناعي الاحماء خلية تدفق إلى 37 درجة مئوية (يمكن القيام بذلك في الحاضنة 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO 2 لنحو 30 دقيقة). إضافة CD4 + الإنسان تنشيط خلايا تي (2-5×10 6 / تدفق الخلية) في HBS / هائل سعيد أنعم ~ 400 ميكرولتر بواسطة حقنة 1 مل. دعونا نعلق على خلايا طبقة ثنائية ل45 دقيقة ~ في الحاضنة 37 درجة مئوية. إذا تم استخدام غرف Ibidi، تزويد عازلة إضافية كل 15-20 دقيقة. تحديد الخلايا عن طريق حقن بارافورمالدهيد 2٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. غسل 3x مع 1ml درجة حرارة الغرفة العازلة في برنامج تلفزيوني. Permeabilize الخلايا عن طريق ضخ 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل 3x مع 1ml من درجة حرارة الغرفة العازلة في برنامج تلفزيوني (عندما يحقق للبروتينات فسفرته، يمكنك إضافة فانادات الصوديوم في تركيز 1MM نهائي أو آخر المانع الفوسفاتيز في برنامج تلفزيوني لمنع إزالة الفوسفات خلال التجهيز). منع استخدام الكازين مع مصل الماعز 5٪ لل25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نوع من المصل حيوان يعتمد على الأجسام المضادة الثانوية. غسل 3x مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة في برنامج تلفزيوني. إضافة الجسم المضاد الأولي في 300 ~ العازلة خلية / ميكروليتر تدفق لمدة 30 دقيقة – 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. للكشف الأولي إشارة التنشيط غشاء الداني، ونحن استخدام الاجسام المضادة المحددة لفسفرته LCK (pLck)، أو مجموع LCK فين. غسل 3x مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة في برنامج تلفزيوني. إضافة الأجسام المضادة المناسبة الثانوية fluorescently المسمى في المخزن كما فعلت مع الأجسام المضادة الأولية. لتجاربنا، ونحن نستخدم اليكسا فلور 568 المسمى الماعز المضادة للأرنب الثانوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل 3x مع 1 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: من الضروري أن يكون لها سيطرة طبقة ثنائية أن يتم التعامل مع الجسم المضاد الوحيد الثانوي (أي الأجسام المضادة الأولية). اتبع الخطوات من 4،1-4،5 والقفز 4.6، ثم المضي قدما في خطوة 4.7. هذا وسوف يحدد مستوى غير محدد ملزم من الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بك. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام التسمية مباشرةالأجسام المضادة إد الأولية. 5. الحصول على الصور بواسطة المجهر TIRF TIRF المجهري يسمح إثارة للإشارات فلوري تقتصر على نانومتر 250 أو أرق طائرة في الركيزة الزجاج واجهة الخلية. هذا يضمن الحصول على الصور من اشارات فقط من طبقة ثنائية المادة الدهنية، ومن أغشية الخلايا apposed فورا. لذلك، يتم تصوير جزيئات فقط في المشبك. لأن الصور TIRF فقط في منطقة الأغشية القريبة في الجزء السفلي من الخلية، لن البروتينات التي يتم استيعابها أو إعادة توزيعها في غشاء ظهري يمكن الكشف عنها. قد يكون من المهم بعد ذلك للحصول على الصور من قبل بالإضافة إلى ذلك widefield معيار أو متحد البؤر المجهري لتحديد ما تراكم أو التوزيع من البروتينات في منطقة متشابك بالمقارنة مع كميات أخرى من الخلية. جميع الشركات المصنعة للمجهر الرئيسية (لايكا، نيكون، أوليمبوس، زايس) هدف بيع أنظمة TIRF المضيئة التي تعمل بشكل جيد لهذا ا ف بالثني. في حين تقدم الشركة كل أشكال مختلفة من الإضاءة TIRF والميزات التشغيلية الأخرى، جودة الصورة هو في الأساس نفسه. كل مجهر TIRF لديها تفاصيل خاصة بها لعملية، ولكن القواعد العامة التالية تنطبق على الحصول على عالية الدقة التصوير. وينبغي أن تكون الإضاءة منخفضة لتجنب التبييض. ينبغي للكاميرا الحصول على رد خطي. يجب أن تكون الكاميرا قادرة على تصوير مجموعة واسعة ديناميكية مع عدم وجود تشبع. يجب تعيين كافة الإعدادات ثابت لتحليل كمي. 6. تحليل البيانات لدراسة الاشارات بين الخلايا تنشيط نتيجة CD4 + T تفاعل الخلايا مع gp120 في VS، تتم تحليلات كمية من الصور TIRF لتحديد ما إذا كان يشير إلى داخل الخلايا جزيئات مثل LCK وفين يتم تنشيط وتجنيدهم للالمشبك 15. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تنطبق على تحليل معظم الصورحزم التطبيقات مثل يماغيج وMetamorph. وقد استخدمنا يماغيج، الذي يعمل على ويندوز وماكنتوش، ولينكس، لدينا وسيلة هنا 12. في علامة التبويب> تحليل قياسات أطقم، والتحقق من صناديق المنطقة ومتوسط قيمة اللون الرمادي. عندما قمت بإجراء المنطقة من الفائدة على الصورة التي هو مضلع أو مرفوعة تتبع شكل مغلق ولا تحليل> قياس، يقوم البرنامج وضع البيانات من هذا القياس في جدول النتائج. سوف تكون المنطقة في عدد من بكسل أو في 2 ميكرون. الوسطية هي كثافة متوسط في وحدات التعسفي. يجب أن يكون كثافة الخلفية تطرح من ذلك. ضرب خلفية يعني ناقص من حيث المساحة ترجع شدة متكاملة من البروتين في وحدات التعسفي. ضبط القياسات لمتوسط والمنطقة. فتح الصور لشرط واحد التجريبية. لكل خلية، وتعقب وقياس المنطقة من اهتمام (يعني)، وتعقب وقياس منطقة خارج المنطقة من اهتمام (الخلفية). عندما تنتهي من ذلك مع شرط واحد التجريبية، والقياسات إما نسخة ولصقها في Excel أو غيرها من برنامج جدول بيانات أو حفظ القياسات. العودة إلى الخطوة 6،2 لكل حالة تجريبية. عندما يتم الانتهاء من القياسات، وحساب النتائج. الصيغ هي: متوسط كثافة = يعني – خلفية المتكاملة شدة = * متوسط كثافة المنطقة 7. ممثل النتائج لقياس تفعيل وتوظيف جزيئات الأغشية القريبة الأولي يشير LCK وفين نتيجة للتفاعل مع gp120 في VS، وأدخلت CD4 الإنسان الأساسية + الخلايا التائية على طبقات ثنائية تحمل gp120 وICAM 1-15. عمل الخلايا التي أدخلت على طبقات ثنائية مع ICAM-1 فقط كعنصر تحكم لتحديد المستويات القاعدية من الإشارات. جمعية مهندسي البترولوقد تم قياس كثافة مضان cific داخل منطقة التماس gp120 للخلايا في gp120 وICAM-1 التي تحتوي على طبقات ثنائية وداخل منطقة التماس كامل للخلايا التفاعل مع طبقة ثنائية ICAM-1. زيادة كثافة مضان متوسط هو علامة المعزز تجنيد وتنشيط جزيء مما يشير إلى VS. وسيتم هذا أظهر مزيدا من زيادة مماثلة في عدد من كثافة مضان متكاملة. إذا ومع ذلك، لا يوجد أي تغيير في كثافة مضان المتكاملة، وهذا يشير إلى إعادة توزيع للجزيء إشارة. بعد الخلايا التي تحتوي على طبقات ثنائية تفاعلت مع gp120 وICAM-1، مجموع LCK وpLck (Y394) تم تعيين إلى واجهة VS وcolocalized مع gp120 (الشكلان 1 و 2). وكان متوسط كثافة من مجموع LCK (الشكل 1) أعلى على طبقة ثنائية تحتوي على كل من gp120 وICAM-1 من مع ICAM-1 وحده، ولكن مستويات كثافة متكامل (الشكل 1) كانت مشابهة، مما يدل على أن يتم توزيعها في LCKكتلة مركزية على خلايا CD4 + T ملزمة لgp120. ومع ذلك، أظهرت الكمي للpLck (Y394) (الشكل 2) إلى أن متوسط كثافة في gp120 وICAM-1 التي تحتوي على طبقات ثنائية كان أعلى من ذلك على طبقات ثنائية ICAM-1 وحده، وكثافة متكاملة كان أعلى في طبقات ثنائية مع كل من gp120 وICAM -1 من التركيز على طبقات ثنائية ICAM-1 وحده. هذا يشير إلى أنه في حين أن مستويات مجموع LCK في واجهة مماثلة في خلايا الانضمام على gp120 وICAM-1-1 و ICAM طبقات ثنائية وحده، gp120 ملزم الفسفرة زادت من بقايا Y394 في LCK حلقة التنشيط. في المقابل، لم يتم تجنيد فين لVS (الشكل 3)، وأكثر فين كان موجودا في منطقة التماس من الخلايا في طبقات ثنائية ICAM-1 وحده من التركيز على طبقات ثنائية تحتوي على كل من gp120 وICAM-1. وبالتالي، فإننا نستنتج أن LCK، لا فين، هو كيناز نشط في VS HIV-1 gp120 التي يسببها. حقائق وارقام: الأغشية القريبة إشارات في HIV-1 gp120 التي يسببها VS. صور من الخلايا ممثل فيوتظهر gp120 + ICAM-1 طبقة ثنائية (لوحات أعلى) وICAM-1 طبقة ثنائية (لوحات أسفل). وتم قياس كمية كثافة مضان من الخلايا الفردية داخل مناطق تتبع يدويا من آثار أقدام الخلية كما يتضح من هذه المنطقة التي تحمل علامة الخط الأصفر في الشكل 1. وتعرض الكمي لشدة متوسط ومتكامل الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري TIRF في الرسوم البيانية اليسار واليمين، على التوالي. وتم قياس كمية ما مجموعه من 30 الى 350 خلية لكل حالة. قضبان = 5 ميكرون. وتظهر البيانات من واحدة من التجارب تكرار الثلاثة. وأدخلت رقم 1. خلايا CD4 + T على طبقات ثنائية تحتوي على gp120 وICAM 1-1-ICAM أو وحده لمدة 45 دقيقة ثم ثابتة وملطخة لمجموع LCK. تم إدخال الشكل 2. خلايا CD4 + T على طبقة ثنائيةالصورة التي تحتوي على gp120 وICAM 1-1-ICAM أو وحده لمدة 45 دقيقة وثابتة وملطخة ثم لpLck (Y394). وأدخلت الرقم 3. خلايا CD4 + T على طبقات ثنائية تحتوي على gp120 وICAM 1-1-ICAM أو وحده لمدة 45 دقيقة ثم ثابتة وملطخة لفين مجموعه.
Discussion
كانت دراسات سابقة قد VS تصور في النظام المتقارن خلية خلية، ولكن هذه الدراسات لم تقدم صورا من القرار عالية بما يكفي لتصور هياكل supramolecular في المشبك. في المختبر، تستخدم نحن على الزجاج المدعومة من نظام طبقة ثنائية مستو لتمثيل سطح الخلايا المصابة معربا عن gp120 مظروف الفيروس وجزيء التصاق الخلوية ICAM-1. بالتزامن مع المجهري TIRF، الذي يكتشف إشارات مضان ضمن 100-200 نانومتر من سطح طبقة ثنائية مع نسبة إشارة إلى الضجيج عالية، وكنا قادرين على كشف فصل supramolecular من gp120 من ICAM-1 في VS. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق الطريقة المناعية قياسية لنظام طبقة ثنائية، وكان يستخدم هنا لكشف وتحديد توظيف محددة من LCK نشط، ولكن ليس فين، إلى منطقة gp120 تلامس في مقابل 15. وبالتالي، فإن طبقة ثنائية مستو يوفر نظام تجريبي للتصوير عالي الدقة من واجهة المشبك في طائرة 2D بواسطة الصغرى TIRFالتنظير، فضلا عن أساليب الإضاءة واسعة حقل أو متحد البؤر. ومع ذلك، فإن النظام لديه أيضا القيود المفروضة على التنقل تعديل يجند، الخروج من الطائرة الانحناء، ولا يرد تقلبات الأغشية البيولوجية بواسطة طبقات ثنائية مستو. وعلاوة على ذلك، وهذا هو النظام في المختبر، وبالتالي قيود أخرى، مثل عدم وجود جزيئات الأغشية الأخرى التي من شأنها أن تكون موجودة على الخلية المصابة، وآلات الهيكل الخلوي الذي ينظم الحركة الجزيئية والحركة الخلوية. أيضا، قد لا ديناميات والتوزيع من الجزيئات، مثل trimers مقابل أحادية من gp120، أن تكون ممثلة من الناحية الفسيولوجية على طبقة ثنائية. ومع ذلك، حتى مع هذه القيود، فإن هذا النظام لا تزال قيمة للغاية لدراسة الفيروسات الخلية أو التفاعلات خلية خلية، وهذه الأساليب يمكن أن تكون بمثابة دليل مفيد للباحثين الذين يبحثون عن صور عالية الدقة للكشف عن تنظيم supramolecular غير ملحوظ في النظام التقليدي المتقارن خلية خلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI071815 (CEH)، وتطوير خارطة الطريق لطب النانوي جائزة المركز PN2EY016586 (MLD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| His tagged HIV gp120 | Gift from Dr. Cho | DH12 | |
| His tagged HIV gp120 | Immune Technology | Various X4 or R5 tropic | |
| HSA | Williams Medical Company | 521302 | Human Serum Albumin 25% |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30K |
| Lck Rabbit mAb | Cell Signaling | 2787 | |
| p-Lck Rabbit pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc. | Sc-101728 | Tyr 394 |
| Fyn Rabbit mAb | Millipore | 04-353 | |
| Alexa Fluor 568 2° Ab | Molecular Probes | A11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A-20000 | carboxylic acid succinimidyl ester |
| FCS2 Chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| 30mm Round w/holes | Bioptechs | 1907-08-750 | 0.75mm thick |
| Rectangle Gasket | Bioptechs | 1907-1422-250 | 14×24 0.25mm thick |
| Tygon Tubing | Bioptechs | 20202275 | 1/16″ (25ft) |
| Three-way Stopcock | BioRad | 7328103 | |
| Two-way Stopcock | BioRad | 7328102 | |
| Sticky Slide I 0.2 Luer | Ibidi | 80168 | |
| Cover glasses | Ibidi | 10812 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| DOGS-NTA | Avanti Polar Lipids | 790404C | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Glass coverslip | Bioptechs | 40-1313-0319 | 40mm |
| TIRF microscope | Nikon | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions. J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).
- Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics. J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).
- Dustin, M. L. Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58. J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).
- Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
- Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1. Aids. 10, 1611-1620 (1996).
- Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).
- Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission. J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).
- Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).
- McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. , 682898-682905 (1994).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
- Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse. J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).
- Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells. J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).
- Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature. 441, 847-852 (2006).
Tags
HIV-1EnvelopeVirological SynapseSignalingSynthetic Lipid BilayersCell To Cell TransmissionCD4+ T CellsF-actinGp120Chemokine Receptor (CKR)CCR5CXCR4LFA-1ICAM FamilyVirus-infected Donor CellsTarget CellsHIV-1 VirionsIntracellular Signaling EventsTCR SignalosomeLckCD3ζZAP70LATSLP-76ItkPLCγSupramolecular Arrangement
Cite This Article
Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (61), e3757, doi:10.3791/3757 (2012).