Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

1. Beschriften GP120 Fluoreszierende Farbstoffe in diesem Protokoll verwendet wirksam sind für die Bindung an Proteine, sind ausreichend stabil für Photo-Imaging-Mikroskopie, und entsprechen den Anregungswellenlängen der Laser mit unserem Mikroskop. Diese drei Kriterien müssen erfüllt sein bei der Auswahl von fluoreszierenden Molekülen für Tagging-Proteine. Seine Börse gp120 DH12 (ein Geschenk von Dr. Michael Cho, der Iowa State University) Protein-Puffer zu sterilem PBS mit einem Zentrifugalfiltereinheit (30 kDa MWCO) 6-Tag. Stellen Sie sicher, gp120-Konzentration ist nicht mehr als 1 mg / ml. Hinweis: His 6-markierten gp120-Proteine ​​aus anderen X4 oder R5 Tropic Stämme wurden ebenfalls getestet und sind nun im Handel erhältlich von Immune Technologies. In Natriumbicarbonat pH 9,0 in einen Protein-Lösung für 50 mM Endkonzentration von Natriumbicarbonat mit ~ pH 8,5 zu erhalten. Fügen Sie aminreaktive Alexa Fluor 488 (AF488) Fluoreszenzfarbstoff, der ist dissolved in Wasser bei einer 10-fachen molaren Überschuss. Inkubieren dieser Mischung für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Um die überschüssige Farbe zu entfernen, verwenden Sie die Zentrifugalfiltereinheit wie vor und mit frischem sterilem PBS auf die Säule. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle freie Farbstoff entfernt wird (3-4 Wäschen mit 4 ml PBS). Drehen nach unten, bis gp120 bis etwa 1 mg / ml konzentriert. Hinweis: Das Entfernen freier Farbstoff durch Dialyse oder Zentrifugalfiltereinheit funktioniert nur, wenn der Farbstoff wasserlöslich ist, oder auch Gelfiltration verwendet werden. Um die Fluoreszenzintensität pro Molekül Protein (F / P) des markierten Proteins zu messen, die Konzentrationen (in uM) des fluoreszierenden Farbstoffs bei der geeigneten Wellenlänge (z. B. bei 488 nm für AlexaFluor 488) und Protein (wir verwenden NanoDrop ein Spektralphotometer mit den 'Proteine ​​und Etiketten "-Einstellung) und dann teilen diese beiden Zahlen geben Ihnen die F / P-Verhältnis. Das gleiche Verfahren wird für andere Proteine ​​und Farbstoffe, wie ICAM-1 und Cy5 verwendet. Hinweis: Andere Arten von spectrophotometers kann die Proteinkonzentration und Fluoreszenzfarbstoff-Konzentration zu erhalten, um die F / P-Verhältnis zu erhalten, wenn ein NanoDrop nicht verfügbar ist. 2. Durchfluss-Modul und Bilayer Vorbereitung Das allgemeine Verfahren zur Durchflusszelle und Doppelschicht Herstellung im Detail zuvor 14 beschrieben worden. Hier skizzieren wir speziell das Protokoll zu Doppelschichten mit His 6-markierten gp120 DH12 auf einem Bioptech Flusszelle vorzubereiten. Für Studien mit infektiösen Viren oder infizierten Zellen und, wenn kleine Mengen erforderlich sind aufgrund der begrenzten Reagenzien, ein Einweg-Strömungskammer ibidi (klebrige Folie I 0,2 Luer) verwendet werden und mit der gleichen Zwei-Schichten-Verfahren zur Aufbereitung von 2,4-2,9 Schritte befolgt werden. Informationen für ibidi Strömungskammern kann von der Website des Unternehmens, bezogen werden http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </a>. Bereiten Pirhana Lösung (45 ml Schwefelsäure (Spurenmetall Grade 98%) und 15 ml 30% iges Wasserstoffperoxid) 14. Mit Kunststoff-Klemmen, rutscht tauchen Abdeckung in der Pirhana Lösung für 15 Minuten. Übertragen Sie Deckgläschen in ein Becherglas mit Pica-gereinigtes Wasser gefüllt und waschen Sie sich ein unter fließendem Wasser für 2 Minuten (1 Minute auf jeder Seite). Platz am Regal zum Trocknen. Montieren Bioptechs FCSII Kammern wie zuvor 14 beschrieben. Ein Liposom Gemisch, das 12,5% Ni 2 +-Chelat-Lipide ist für die Erfassung und Präsentation von His 6-gp120 auf der Oberfläche Doppelschicht 16 verwendet. Fügen Sie 1 ul Tropfen der Mischung auf die Liposomen-microaqueduct Rutsche ohne Berührung der Spitze bis zum Glas. Um das Maximum von 5 Doppelschichten pro Messzelle vorbereiten, wiederholen Sie bis zu 4 mal mehr so, dass es fünf 1μl Punkte sind wie zuvor gezeigt 14. Zeigen Deckglas oben auf Lipide. Bedecken Sie den weißen Sicherungsring mit einem Edelstahl-clamp Basiseinheit, drehen Sie den ganzen Apparat auf und versiegeln. Markieren Lage von Doppelschichten mit einem Marker. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Befestigen Sie Schlauch mit Zwei-Wege-Hahn nach links Perfusion Röhre wie beim Video gezeigt. Einen positiven Meniskus am Ende des Schlauchs mit dem 3-Wege-Hahn auf sie (Schlauch wurde vorher mit HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) mit Human Serum Albumin (HSA) (HBS / HSA gefüllt: 50 ml 10x HBS [10x HEPES-gepufferte Salzlösung: 200 mM HEPES, pH 7,2, 1,37 M NaCl, 50 mM KCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 60 mM D-Glucose] 20 ml HSA 25x, 500 ul 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgCl 2 und dH 2 0 bis zu einem Gesamtvolumen zu 500ml und Filter mit 0,22 &mgr; m-Filter) zu bringen und ist frei von Blasen. Schlauch an rechten Perfusion Rohr und schieben Puffer durch Messzelle. Blockieren Sie Doppelschicht mit ~ 300 ul von Kasein enthalten 100 uM NiCl 2, indem 1 ml-Spritze und Anbringen an den offenen Teil des 3-Wege-Hahn. GenTLY schieben Puffer durch und schließen Sie beide Hähne vor Ausrücken der Spritze. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur. In His 6-markierten AF488-markiertem gp120 (die Konzentration wird bestimmt, wie zuvor in 16 beschrieben). Wir verwenden ~ 250 Moleküle gp120/μm 2, um die lokale Dichte der Env-Cluster auf HIV-1 Virion Fläche 17 zu imitieren. Ebenso nutzen wir ~ 250 Moleküle / &mgr; m 2 von ICAM-1 auf der Doppelschicht, wie zuvor berichtet 14. Legen Sie in Flusszelle mit Casein als getan. Inkubieren für 30 min im Dunkeln (mit Folie abdecken) bei Raumtemperatur. Das gleiche Verfahren wird verwendet, um andere Proteine ​​wie His 12-markierte ICAM-1 auf der Doppelschicht Cy5-markierten übernehmen. Waschen Doppelschichten mit 5 ml Puffer. 3. Qualitätskontrolle von Doppelschichten über FRAP Proteine, die in Doppelschichten müssen seitlich diffusionsfähig. Vor dem Hinzufügen von Zellen auf Doppelschichten, ist es wichtig, die versichern,Mobilität von Proteinen in die vorbereitete Doppelschicht. Hier beschreiben wir eine Fluoreszenz-Recovery After Photobleaching (FRAP) Methode 3, die manuell kann auf den meisten objektiv beleuchtet TIRF, weites Feld Epifluoreszenz, oder Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopen durchgeführt werden. Das Ziel ist es, Bild vollständig gleichförmige Felder von Fluoreszenz in der Lipid-Doppelschicht, Bleichmittel vor Ort, und um die Rückkehr der abgeschreckten Moleküle der gebleichten zu überwachen. Eine Erholung von 50% innerhalb von 2 Minuten kann akzeptabel sein. Alle großen Hersteller von Mikroskopen (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) verkaufen objektiv beleuchtet TIRF-Systeme, die gut funktionieren für diese Anwendung. Während jedes Unternehmen bietet Variationen von TIRF-Beleuchtung und andere betriebliche Funktionen, ist die Bildqualität im Wesentlichen gleich. Verwenden Sie einen niedrigen Anregungsintensität, um ein Ausbleichen. Verwenden Sie eine hohe numerische Apertur Ziel wie einer NA von 1,3 bis 1,45, 40x, 60x oder 100x. Bei Verwendung eines Standard-Fluoreszenz-oder TIRF-Mikroskop, um die Licht intens reduzierenITY, legte Graufilter in der Anregungslichtweg. Die meisten Laser-Systeme können für geringe Ausleuchtung durch Setzen eines akusto optische Filter (AOTF) oder akusto optischen Strahlteiler (AOBS) mit niedriger Spannung eingestellt werden. Nehmen Sie eine "Pre-Bleiche" Bild. Bei Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera, um für schlechte Lichtverhältnisse ausgleichen zu Binning 2×2 oder 4×4 gesetzt werden kann, kann die Verstärkung hohe oder lange Belichtungszeiten (etwa in der Größenordnung von Sekunden) eingestellt werden können verwendet werden. Bei Verwendung eines konfokalen, kann die Lochblende geöffnet werden; die Verstärkung hoch angesetzt, und langsames Scanning oder Mittelwertbildung herangezogen wird. Bleach einen Platz. Bei Verwendung eines Standard-Fluoreszenz-oder TIRF-Mikroskop, entfernen Sie alle ND-Filter, um für maximale Intensität Beleuchtung ermöglichen, schließen Sie die Leuchtfeldblende, und setzen die Probe für ein paar Sekunden. Bei Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning, stellen Sie die maximale Laserleistung und zoomen Sie in ca. 4x auf 8x zu bleichen einen Platz. Eine Warnung für die konfokale Nutzung: nicht in zu hoher zoomen, weil der Doppelschicht kann durch ANLAUFZEIT beschädigt werdenausschließlich konzentriert Photonen. Bei 10 bis 15 Sekunden-Intervallen, die Aufnahme von Bildern mit den gleichen Beleuchtungs-und Aufnahme-Einstellungen wie in 3.1 und 3.2. Innerhalb von zwei bis drei Minuten sollte der Spot erholen Intensität nähert sich, dass der "Pre-Bleiche" Bild. Schnelle Erholung ist das Zeichen eines erfolgreichen mobilen Doppelschicht. Wenn der Fleck bleibt dunkel, und vor allem, wenn der Rand behält einen hohen Kontrast, sind die fluoreszierenden Proteine ​​unbeweglich in der Doppelschicht und sollte nicht für das Experiment verwendet werden. Hinweis: In unserem aktuellen Mikroskop können wir 0,9 mW von 641 nm-Licht zu einer kreisförmigen Fleck liefern mit einer Fläche von 240 mu m 2, die Fluoreszenz-ICAM bleicht bei typischen Konzentrationen in weniger als 4 Sekunden. Die Leser sollten diesen kritischen Ausrichtung eines Hg oder Xe-Lampe mit Bleiche mal weniger als 30 Sekunden ist mehr als ausreichend, um diesen Test in einer wiederholbaren Weise wahrnehmen zu finden. Wir würden auch verweisen Sie auf die 3 für zusätzliche det verweisenfehlt. 4. Injektion von Zellen und Immunfluoreszenzfärbungen Aufwärmen Durchflusszelle bis 37 ° C (dies kann in einem 37 ° C-Inkubator ohne CO 2 für etwa 30 min durchgeführt). In aktivierten humanen CD4 + T-Zellen (2-5×10 6 / Flusszelle) in HBS / HSA ~ 400 ul von 1 ml-Spritze. Lassen Zellen zu befestigen Doppelschicht für ~ 45 min im 37 ° C Inkubator. Wenn die ibidi Kammern eingesetzt werden, liefern zusätzliche Puffer alle 15-20 min. Befestigen Sie die Zellen durch Injektion von 2% Paraformaldehyd und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 ° C Waschen mit 1 ml PBS-Puffer Raumtemperatur 3x. Permeabilisieren Zellen durch Injektion 0,1% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen mit 1 ml Raumtemperatur PBS-Puffer (wenn Sondieren für phosphorylierte Proteine, können Sie Natriumvanadat bei 1mm Endkonzentration oder anderen Phosphatase-Inhibitors in PBS hinzufügen, um Phosphat-Entfernung während der Verarbeitung zu verhindern) 3x. Sperren unter Einsatz von Casein mit 5% Ziegenserum25 Minuten bei Raumtemperatur. Die Art tierisches Serum hängt von dem sekundären Antikörper. Waschen mit 1 ml PBS-Puffer Raumtemperatur 3x. In primären Antikörper in ~ 300 ul Puffer / Flusszelle für 30 min – 1 h bei Raumtemperatur. Um die anfängliche Membran-proximalen Aktivierung Signal zu erfassen, verwenden wir spezifische Antikörper gegen phosphorylierte Lck (PLCK), Gesamt-Lck oder Fyn. Waschen mit 1 ml PBS-Puffer Raumtemperatur 3x. In geeigneten fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper in Puffer wie bei primärer Antikörper durchgeführt. Für unsere Experimente verwenden wir Alexa Fluor 568-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur. Waschen mit 1 ml PBS-Puffer 3x. Hinweis: Es ist wichtig, um ein Steuerelement-Doppelschicht, die mit nur sekundären Antikörper (kein primärer Antikörper) behandelt wird, haben. Folgen Sie den Schritten von 4,1 bis 4,5 und 4,6 überspringen, dann mit 4,7 Schritt fortfahren. Dies bestimmt den Umfang der nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörpers. Alternativ kann man direkt verwenden Etiketted primären Antikörper. 5. Bildaufnahme durch TIRF-Mikroskopie TIRF Mikroskopie ermöglicht Anregung von Fluoreszenz-Signalen, die nur an 250 nm oder dünner Ebene an dem Glassubstrat und Zell-Schnittstelle. Dies garantiert Bildaufnahme nur Signale aus dem Lipid-Doppelschicht und von den unmittelbar angelagert Zellmembranen. Daher werden nur Moleküle an der Synapse abgebildet. Da TIRF geben nur die Membran-proximalen Bereich am Boden der Zelle, wird Proteine, die internalisiert oder in die dorsale Membran verteilt nicht erkannt werden. Es kann dann wichtig sein, zusätzlich zu erwerben Bilder von Standard-Weitwinkel-oder konfokalen Mikroskopie zur Akkumulation oder die Verteilung der Proteine ​​im synaptischen Bereich bestimmen, wie zu den anderen Bänden der Zelle verglichen. Alle großen Hersteller von Mikroskopen (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) verkaufen objektiv beleuchtet TIRF-Systeme, die gut funktionieren für diese apdung. Während jedes Unternehmen bietet Variationen von TIRF-Beleuchtung und andere betriebliche Funktionen, ist die Bildqualität im Wesentlichen gleich. Jeder TIRF-Mikroskop verfügt über einen eigenen Angaben für den Betrieb, aber die folgenden allgemeinen Regeln gelten für die hochauflösende Bildgebung zu erhalten. Die Beleuchtung sollte gering sein, um zu vermeiden Bleichen. Die Kamera sollte eine lineare Antwort. Die Kamera sollte in der Lage sein Bildgebung einen breiten dynamischen Bereich ohne Sättigung. Alle Einstellungen sollte konstant für quantitative Analysen werden. 6. Datenanalyse Um die intrazelluläre Signale durch CD4 + T-Zell-Interaktion mit gp120 in der VS aktiviert zu untersuchen, werden quantitative Analysen von TIRF Bildern erfolgen, ob intrazelluläre Signalmoleküle wie Lck und Fyn aktiviert und eingestellt, um der Synapse 15 zu bestimmen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode daher für die meisten BildanalyseAnwendungspakete wie ImageJ und Metamorph. Wir haben ImageJ, die auf Windows-, Macintosh-und Linux läuft, für unsere Methode hier 12 verwendet. Im Analysieren> Set Registerkarte Messungen, die Kontrollkästchen, sowie die mittlere Grauwert. Wenn Sie eine Region von Interesse zu machen auf das Bild, das ein Polygon oder ein Freihand-Form zurückgeführt geschlossen ist und keine> measure, wird die Software die Daten aus dieser Messung in einer Ergebnisliste Tisch zu legen. Das Gebiet wird in Anzahl der Pixel oder in mu m 2 sein. Der Mittelwert ist der durchschnittliche Intensität in willkürlichen Einheiten. Es muss über Hintergrund-Intensität von ihm subtrahiert. Multiplizieren des Mittelwerts minus Hintergrund der Fläche gibt die integrierte Intensität des Proteins in willkürlichen Einheiten. Stellen Sie die Messungen zu verstehen und Umgebung. Öffnen Sie Bilder für einen experimentellen Zustand. Für jede Zelle verfolgen und messen Sie die Region of Interest (Mittelwert) und zu verfolgen und messen einen Bereich außerhalb des Bereichs von Interesse (im Hintergrund). Wenn mit einer experimentellen Bedingung gemacht, entweder Messungen Kopie und Paste in Excel oder anderen Tabellenkalkulationsprogrammen oder speichern Sie die Messungen. Zurück zu 6,2 für jede experimentelle Bedingung fort. Wenn die Messungen abgeschlossen sind, berechnen Sie die Ergebnisse. Die Formeln sind: Durchschnittliche Intensität = Mittelwert – Hintergrund Integrierte Intensität = Mittlere Intensität * Bereich 7. Repräsentative Ergebnisse Um die Aktivierung und Einstellung von der ersten Membran-proximalen Signalmoleküle Lck und Fyn als Ergebnis der Interaktion mit gp120 in der VS zu messen, wurden primäre menschliche CD4 + T-Zellen auf Doppelschichten trägt gp120 und ICAM-1 15 eingeführt. Zellen eingeführt, um Doppelschichten mit nur ICAM-1 diente als Kontrolle, um die basalen Ebenen der Signalisierung zu definieren. Specific Fluoreszenzintensität innerhalb des gp120 Kontaktfläche für Zellen auf gp120 und ICAM-1 mit Doppelschichten und innerhalb der gesamten Kontaktfläche für die Interaktion mit Zellen des ICAM-1-Doppelschicht gemessen. Eine Erhöhung der durchschnittlichen Intensität der Fluoreszenz ist ein Zeichen von Augmented Rekrutierung und Aktivierung des Signalmoleküls an den VS. Dies wird durch eine vergleichbare Erhöhung der integrierten Fluoreszenz-Intensität nachgewiesen werden. Wenn jedoch gibt es keine Änderung in der integrierten Fluoreszenzintensität, zeigt dies eine Umverteilung des Signalmoleküls. Nachdem die Zellen mit Doppelschichten mit gp120 und ICAM-1, insgesamt Lck und PLCK (Y394) interagierten wurden dem VS-Schnittstelle rekrutiert und kolokalisiert mit gp120 (Abb. 1 & 2). Die durchschnittliche Intensität von insgesamt Lck (Abb. 1) war höher auf der Doppelschicht, die sowohl gp120 und ICAM-1 als mit ICAM-1 allein, sondern die integrierten Intensitäten (Abb. 1) waren ähnlich, was darauf hindeutet, dass Lck in umverteilt wirdein zentrales Cluster auf CD4 + T-Zell-Bindung an gp120. Jedoch zeigten Quantifizierung PLCK (Y394) (Abb. 2), daß die mittlere Intensität auf gp120 und ICAM-1 enthaltenden Doppelschichten höher war als das auf die ICAM-1 allein Doppelschichten und die integrierte Intensität war höher auf Doppelschichten mit sowohl gp120 und ICAM -1 als auf ICAM-1 allein Doppelschichten. Dies zeigt, dass, während die Pegel der gesamten Lck an der Grenzfläche in Zellen ähneln anhaftenden auf gp120 und ICAM-1 und ICAM-1 allein Doppelschichten, gp120-Bindung erhöhte Phosphorylierung des Y394-Rest an der Lck Aktivierungsschleife. Im Gegensatz dazu wurde Fyn nicht an den VS eingestellt (Abb. 3), wie Fyn vorhanden war im Kontaktbereich von Zellen auf ICAM-1 allein Doppelschichten als auf Doppelschichten, die sowohl gp120 und ICAM-1. Folglich schließen wir, dass Lck, Fyn nicht, ist die aktive Kinase in der HIV-1 gp120-induzierte VS. Fakten: Membran-proximalen Signalisierung bei HIV-1 gp120-induzierte VS. Bilder repräsentative Zellen auf dergp120 + ICAM-1-Doppelschicht (obere Bilder) und die ICAM-1-Doppelschicht (untere Bilder) werden gezeigt. Fluoreszenz-Intensitäten der einzelnen Zellen wurden in von Hand gezeichnete Bereiche der Zelle Spuren quantifiziert durch den Bereich mit der gelben Linie in 1 markiert dargestellt. Quantifizierung der durchschnittlichen und integrierten Intensitäten von TIRF-Mikroskopie nachgewiesen werden in der linken und rechten Graphen dargeboten. Ein insgesamt 30 bis 350 Zellen wurden für jede Bedingung quantifiziert. Bars = 5 um. Daten aus einer der drei Wiederholungseinheiten Experimenten sind dargestellt. 1. CD4 + T-Zellen wurden auf Doppelschichten mit gp120 und ICAM-1 oder ICAM-1 allein für 45 min eingeführt und dann fixiert und gefärbt insgesamt Lck. 2. CD4 + T-Zellen wurden auf Doppelschicht eingeführts mit gp120 und ICAM-1 oder ICAM-1 allein für 45 min und dann fixiert und für PLCK (Y394) gefärbt. Abbildung 3. CD4 + T-Zellen wurden auf Doppelschichten mit gp120 und ICAM-1 oder ICAM-1 allein für 45 Minuten eingeführt und dann fixiert und gefärbt für insgesamt Fünen.