Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

1. Labeling gp120 Fluorescente kleurstoffen die in dit protocol zijn effectief voor het binden aan eiwitten, voldoende foto-stabiel voor microscopie beeldvorming, en overeenkomen met de excitatie golflengtes van de lasers beschikbaar met onze microscoop. Deze drie criteria moet worden voldaan bij het selecteren van fluorescerende moleculen voor tagging eiwitten. Exchange Zijn 6-gelabeld gp120 DH12 (een gift van Dr Michael Cho, Iowa State University) proteïne buffer om steriele PBS met behulp van een centrifugaal filter (30 kDa MWCO). Zorg ervoor dat gp120 concentratie niet meer dan 1 mg / ml. Let op: Zijn 6-gelabeld gp120 eiwitten van andere X4 of R5 tropische stammen zijn ook getest en zijn nu in de handel verkrijgbaar bij Immune Technologies. Voeg natriumbicarbonaat pH van 9,0 naar uw eiwitoplossing tot 50 mm uiteindelijke concentratie van natriumbicarbonaat met ~ pH 8,5 te verkrijgen. Voeg amine reactieve Alexa Fluor 488 (AF488) fluorescente kleurstof, die dissolved in water bij een 10-voudige molaire overmaat. Incubeer dit mengsel gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur in het donker. Om de overtollige kleurstof te verwijderen, gebruikt u de centrifugale filterunit als voorheen en voeg verse steriel PBS tot de kolom. Herhaal stap totdat alle vrije kleurstof wordt verwijderd (3-4 wassen met 4 ml PBS). Spin totdat gp120 geconcentreerd tot ongeveer 1 mg / ml. Opmerking: Het verwijderen vrije kleurstof door dialyse of centrifugale filter werkt alleen als de kleurstof in water oplosbare, of anders gelfiltratie worden gebruikt. Om de fluorescentie intensiteit per molecuul eiwit (F / P) van de gemerkte eiwitten meten wordt de concentratie (in uM) van de fluorescente kleurstof op de juiste golflengte (bijvoorbeeld bij 488 nm voor AlexaFluor 488) en eiwitten (we een NanoDrop spectrofotometer met behulp van de 'eiwitten en labels' instelling) en vervolgens delen deze twee getallen geven u de F / P ratio. Dezelfde procedure wordt gebruikt voor andere eiwitten en kleurstoffen zoals ICAM-1 en Cy5. Opmerking: Andere vormen van spectrophotometers kan worden gebruikt om de proteïneconcentratie en fluorescerende kleurstof concentratie die de F / P verhouding te verkrijgen als een NanoDrop niet beschikbaar. 2. Flow Cell Montage en dubbellaag Voorbereiding De algemene procedure voor doorstroomcel en dubbellaag preparaat is eerder in detail beschreven 14. Hier schetsen we specifiek het protocol bij dubbellagen met zijn 6-gelabeld gp120 DH12 op een Bioptech flow cel voor te bereiden. Voor studies met besmettelijke virussen of geïnfecteerde cellen en bij kleine volumes nodig zijn vanwege de beperkte reagentia, een wegwerp Ibidi flow kamer (sticky Slide I 0,2 Luer) kunnen worden gebruikt en gevolgd met hetzelfde bi-laag voorbereidingsprocedure in de stappen 2.4-2.9. Informatie voor Ibidi stromingskamers kan worden verkregen bij de website van het bedrijf, http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </a>. Bereid Pirhana oplossing (45 ml zwavelzuur (Trace metalen Grade 98%) en 15 ml 30% waterstofperoxide) 14. Met kunststof klemmen, dompel dekglaasjes in de Pirhana oplossing gedurende 15 minuten. Overdracht dekglaasjes in een bekerglas gevuld met pica-gezuiverd water en een ieder onder stromend water gedurende 2 minuten (een minuut aan elke kant) te wassen. Plaats op rek te drogen. Monteer Bioptechs FCSII kamers zoals eerder beschreven 14. Een liposoom mengsel dat 12,5% Ni 2 + chelaatvormende lipiden wordt gebruikt voor het vastleggen en presenteren van zijn 6-gp120 op de bilaag oppervlak 16. Voeg 1 ul druppels liposoom mengsel op de microaqueduct dia zonder het aanraken van de tip om het glas. Om het maximum van 5 dubbellagen per flow cel voor te bereiden, tot herhalen tot 4 keer, zodat er vijf 1 pi stippen zoals eerder 14 aangegeven. Plaats dekglas op de top van lipiden. Bedek de witte borgring met een roestvrij stalen clamp basisstation, moet u het hele apparaat om en af ​​te dichten. Markeer locatie van dubbellagen met een marker. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Sluit buis met twee wegkraan links perfusie buis, zoals getoond in video. Een positief meniscus eind van de buis met de 3-wegkraan op (slang eerder is gevuld met HEPES gebufferde zoutoplossing (GB) humaan serumalbumine (HSA) (GB / HSA 50 ml HBS 10x [10x gebufferde zoutoplossing HEPES 200 mM HEPES, pH 7,2, 1,37 M NaCl, 50 mM KCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 60 mM D-glucose] 20 ml 25x HSA werd 500 ul 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCI2 en dH 2 0 tot een totaal volume tot 500 ml en filter met 0.22μm filter) te brengen en is verstoken van bubbels. Sluit de leidingen naar rechts perfusie buis en voorzichtig buffer door te drukken doorstroming cel. Blokkeer dubbellaag met ~ 300 ul van caseïne met 100 uM NiCl2 door het invullen van 1 ml spuit en verbonden aan het open deel van de 3-weg kraan. Gentgevoerd duwen buffer door en sluit beide kranen voor het ontkoppelen van de spuit. Gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg zijn 6-tag AF488-gelabeld gp120 (de concentratie wordt bepaald als eerder beschreven in 16). We maken gebruik van ~ 250 moleculen van gp120/μm 2 tot en met de lokale dichtheid van Env clusters gevonden op HIV-1 virionoppervlak 17 na te bootsen. Ook we ~ 250 moleculen / um 2 van ICAM-1 de bilaag zoals eerder vermeld 14. Laad in flow cel als gedaan met caseïne. Gedurende 30 min in donker (bedekken met folie) bij kamertemperatuur. Dezelfde procedure wordt gebruikt om andere proteïnen zoals zijn 12 gelabeld Cy5-gelabelde ICAM-1 op de bilaag nemen. Was dubbellagen met 5 ml buffer. 3. Kwaliteitscontrole van dubbellagen via FRAP Eiwitten in dubbellagen moet zijdelings diffundeerbare. Voor het toevoegen cellen op dubbellagen is het belangrijk om te waarborgen datmobiliteit van eiwitten in het bereide bilaag. Hier beschrijven we een TL-Herstel Na Photobleaching (FRAP) methode 3 die handmatig kan worden uitgevoerd op een zo objectief verlicht TIRF, breed epifluorescentie, of laser scanning confocale microscopen. Het doel is om de afbeelding volledig uniform gebied van de fluorescentie in de lipide dubbellaag, bleek een plek, en de terugkeer van gedoofde moleculen aan het gebleekte gebied te controleren. Een herstel van 50% in 2 minuten aanvaardbaar zijn. Alle grote microscoop fabrikanten (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) te verkopen objectieve verlichte TIRF systemen die goed werken voor deze toepassing. Terwijl elk bedrijf levert varianten van TIRF verlichting en andere operationele kenmerken, de beeldkwaliteit is in wezen hetzelfde. Gebruik een laag excitatie-intensiteit te minimaliseren bleken. Gebruik een hoge numerieke apertuur doel zoals NA 1,3 tot 1,45 40x, 60x of 100x. Bij gebruik van een standaard TL-of TIRF microscoop, om het licht intens te verminderenheid, zet grijsfilters in het excitatie licht pad. De meeste laser-systemen kan worden ingesteld voor een slechte verlichting door het instellen van een acusto optische afstembare filter (AOTF) of acusto optische beam splitter (AOBS) met een lage spanning. Neem een ​​"pre-bleekwater" beeld. Bij gebruik van een gekoelde CCD-camera, om te compenseren voor omstandigheden met weinig licht binning kan worden ingesteld op 2×2 of 4×4, kan de versterking worden ingesteld hoge en lange belichtingstijden (bijvoorbeeld in de orde van seconden) kan worden gebruikt. Bij gebruik van een confocale, kan de pinhole opening geopend worden, de winst hoog, en langzame scannen of gemiddeld gebruikt. Bleach een plek. Bij gebruik van een fluorescentie of TIRF microscoop, alle ND filters verwijderd om maximale intensiteit verlichting, sluit het gebied membraan en blootstellen monster gedurende enkele seconden. Bij gebruik van een laser scanning confocale, stelt u de maximale laservermogen en zoom in ongeveer 4x tot 8x voor het bleken van een plek. Een waarschuwing voor confocale gebruik: niet in te zoomen in een te hoog omdat de bilaag kunnen worden beschadigd door excestend geconcentreerd fotonen. Om tien voor vijftien seconden intervallen, op te nemen beelden met dezelfde verlichting en opname-instellingen als in de punten 3.1 en 3.2. Binnen twee tot drie minuten ter plaatse dient te herstellen intensiteit nadert die van de "pre-bleekwater" beeld. Snel herstel is het teken van een succesvolle mobiele dubbellaag. Als de plaats blijft donker en vooral als de rand blijft hoog contrast de fluorescente eiwitten worden onbeweeglijk in de dubbellaag en mag niet worden gebruikt voor het experiment. Opmerking: In onze huidige microscoop, kunnen we 0,9 mW van 641 nm licht te leveren aan een ronde vlek met een oppervlakte van 240 micrometer 2 die TL-ICAM bleekt bij typische concentraties in minder dan 4 seconden. Lezers moeten vinden dat de kritische lijn van een Hg of Xe lamp met bleken keer minder dan 30 seconden is meer dan voldoende om deze test uit te voeren in een herhaalbare manier. We willen ook verwijzen naar 3 referentie voor extra detscheelt. 4. Injectie van cellen en immunofluorescentiekleuring Warm doorstroomcel tot 37 ° C (dit kan in een 37 ° C incubator met geen CO2 gedurende 30 min). Voeg geactiveerde menselijke CD4 + T-cellen (2-5×10 6 / flow cel) in HBS / HSA ~ 400 ul van 1 ml spuit. Laat cellen om dubbellaag hechten voor ~ 45 min in de 37 ° C incubator. Als de Ibidi kamers worden gebruikt, leveren extra buffer om de 15-20 minuten. Zet de cellen door injecteren 2% paraformaldehyde en geïncubeerd 10 minuten bij 37 ° C. Was 3x met 1 ml kamertemperatuur PBS-buffer. Permeabilize cellen door het injecteren van 0,1% Triton X-100 5 min bij kamertemperatuur. Was 3x met 1 ml van de ruimtetemperatuur PBS-buffer (bij peilen naar gefosforyleerde eiwitten, kunt u natrium vanadaat toevoegen op 1 mM uiteindelijke concentratie of een andere fosfatase inhibitor in PBS om fosfaatverwijdering tijdens de verwerking te voorkomen). Blokkeer met behulp van caseïne met 5% geit serum voor25 minuten bij kamertemperatuur. Het type dier serum afhankelijk van de secundaire antilichaam. Was 3x met 1 ml PBS-buffer kamertemperatuur. Voeg primaire antilichaam in ~ 300 pi buffer / meetcel 30 min – 1 uur bij kamertemperatuur. Om de initiële membraan-proximale activatie-signaal te detecteren, gebruiken we antilichamen die specifiek zijn voor gefosforyleerde Lck (pLck), totaal Lck of Funen. Was 3x met 1 ml PBS-buffer kamertemperatuur. Voeg het juiste fluorescent gelabelde tweede antilichaam in de buffer als voltooid met primaire antilichaam. Voor onze experimenten hebben we gebruik maken van Alexa Fluor 568-gelabeld geit anti-konijn secundair. Incubeer 20 min bij kamertemperatuur. Was 3x met 1 ml PBS buffer. Opmerking: Het is van essentieel belang dat een controle dubbellaag dat behandeld is met slechts secundair antilichaam (geen primaire antilichaam). Volg de stappen 4.1-4.5 en overslaan 4.6, ga dan verder met stap 4.7. Zo bepaalt u de mate van niet-specifieke binding van uw secundaire antilichaam. Als alternatief kan men gebruik maken van direct-labeled primaire antilichamen. 5. Afbeelding overname door TIRF microscopie TIRF microscopie kan excitatie van fluorescerende signalen beperkt tot een 250 nm of dunner vlak op het glazen substraat en cel-interface. Dit garandeert beeldopname slechts signalen van de lipide bilaag en de onmiddellijk apposed celmembranen. Daarom zijn alleen moleculen op synaps afgebeeld. Omdat TIRF beelden slechts het membraan-proximale gebied aan de bodem van de cel, zal eiwitten die worden geïnternaliseerd of herverdeeld de dorsale membraan niet worden gedetecteerd. Het kan dan belangrijk bijkomend beelden te verkrijgen door standaard groothoek of confocale microscopie accumulatie of verdeling van de eiwitten op de synaptische gebied te bepalen ten opzichte van de andere delen van de cel. Alle grote microscoop fabrikanten (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) te verkopen objectieve verlichte TIRF systemen die goed werken voor deze apapplicatie. Terwijl elk bedrijf levert varianten van TIRF verlichting en andere operationele kenmerken, de beeldkwaliteit is in wezen hetzelfde. Elke TIRF microscoop heeft zijn eigen gegevens voor gebruik, maar de volgende algemene regels gelden voor hoge-resolutie beeldvorming te verkrijgen. Verlichtingskunde laag te voorkomen bleken. De camera moet een lineaire respons. De camera moet in staat zijn van de beeldvorming een breed dynamisch bereik met geen verzadiging. Alle instellingen moeten worden ingesteld constante voor kwantitatieve analyses. 6. Data-analyse Om de intracellulaire signalen geactiveerd worden als gevolg van CD4 + T-cel interactie met gp120 in de VS bestuderen worden kwantitatieve analyse van TIRF beelden gedaan of intracellulaire signaalmoleculen zoals Lck en Fyn geactiveerd en aangetrokken de synaps 15 te bepalen. Beschrijven we een eenvoudige methode toepassing meest beeldanalysetoepassingspakketten zoals ImageJ en Metamorph. We hebben gebruik gemaakt ImageJ, dat draait op Windows, Macintosh en Linux, voor onze methode hier 12. In het Analyze> Set Afmetingen tabblad, controleer dan de dozen voor Ruimte en gemiddelde grijswaarde. Wanneer u een gebied van belang te maken op het beeld dat is een veelhoek of een uit de vrije hand getraceerd gesloten vorm en doen> Meet Analyseer, zal de software zet de gegevens van deze meting in een tabel met resultaten. Het gebied wordt het aantal pixels of pm 2. De gemiddelde is van de gemiddelde intensiteit in willekeurige eenheden. Het moet achtergrondintensiteit afgetrokken. Vermenigvuldiging van de gemiddelde minus achtergrond door gebied een geïntegreerde intensiteit van het eiwit in willekeurige eenheden. Zet de metingen te betekenen en Ruimte. Open beelden voor een experimentele conditie. Voor elke cel, op te sporen en te meten het gebied van belang (gemiddeld) en op te sporen en te meten een regio buiten de regio van belang (achtergrond). Als je klaar bent met een experimentele conditie, te kopiëren metingen en plakken in Excel of andere spreadsheet programma of sla de metingen. Keer terug naar 6.2 stap voor elke experimentele conditie. Bij de metingen zijn voltooid, de berekening van de resultaten. De formules: Gemiddelde intensiteit = gemiddelde – achtergrond Geïntegreerde intensiteit = Gemiddelde intensiteit * gebied 7. Representatieve resultaten Activering en rekrutering van de eerste membraan-proximale signaalmoleculen Lck en Fyn meten als een wisselwerking met gp120 in de VS werden primaire humane CD4 + T-cellen geïntroduceerd op dubbellagen met gp120 en ICAM-1 15. Cellen geïntroduceerd dubbellagen slechts ICAM-1 diende als controle van de basale niveaus van signalen bepalen. Specifieke fluorescentie-intensiteit werd gemeten binnen de gp120 contact gebied voor cellen op gp120 en ICAM-1 met dubbellagen en binnen het gehele contactoppervlak voor cellen interactie met de ICAM-1 dubbellaag. Een toename van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit is een teken van augmented werving en activering van het signaalmolecuul naar de VS. Dit zal verder worden aangetoond door een vergelijkbare toename in de geïntegreerde fluorescentie intensiteit. Als er echter geen verandering in de geïntegreerde fluorescentie betekent dit een herverdeling van de signaalmolecule. Nadat de cellen interactie met dubbellagen met gp120 en ICAM-1, totaal Lck en pLck (Y394) werden aangeworven om de VS-interface en colocalized met gp120 (figuren 1 en 2). De gemiddelde intensiteit van de totale Lck (Fig. 1) hoger de bilaag die zowel gp120 en ICAM-1 dan met ICAM-1 alleen maar de geïntegreerde intensiteit (Fig. 1) waren soortgelijk, wat suggereert dat Lck wordt herverdeeldeen centrale cluster op CD4 + T-cel binden aan gp120. Echter, kwantificering van pLck (Y394) (Fig. 2) blijkt dat de gemiddelde intensiteit van gp120 en ICAM-1 bevattende dubbellagen hoger dan die van ICAM-1 alleen dubbellagen en de geïntegreerde intensiteit hoger dubbellagen zowel gp120 en ICAM -1 dan op ICAM-1 alleen dubbellagen. Dit geeft aan dat wanneer de concentraties van totaal Lck het grensvlak gelijk in cellen hechten op gp120 en ICAM-1 en ICAM-1 alleen dubbellagen, gp120 fosforylatie binden verhoogde residu Y394 de Lck activering lus. Daarentegen werd Fyn niet gerekruteerd de VS (Fig. 3), meer Fyn aanwezig was in het contactgebied van cellen op ICAM-1 alleen dubbellagen dan op dubbellagen die zowel gp120 en ICAM-1. Daarom concluderen we dat Lck, niet Fyn, is het actieve kinase in de HIV-1 gp120-geïnduceerde VS. Cijfers: Membraan-proximale signalering bij HIV-1 gp120-geïnduceerde VS. Beelden van representatieve cellen op degp120 + ICAM-1 dubbellaag (boven panelen) en ICAM-1 dubbellaag (bodempanelen) getoond. Fluorescentie-intensiteit van de afzonderlijke cellen werden gekwantificeerd onder hand voeren gebieden van de cel voetafdrukken zoals blijkt uit het gebied aangegeven met de gele lijn in figuur 1. Kwantificering van de gemiddelde intensiteit geïntegreerde gedetecteerd TIRF microscopie zijn weergegeven in de linker en rechter grafieken respectievelijk. Een totaal van 30 tot 350 cellen gekwantificeerd voor elke conditie. Balken = 5 pm. Gegevens van een van de drie herhaalde weergegeven. Figuur 1. CD4 + T-cellen werden op dubbellagen met gp120 en ICAM-1 of ICAM-1 alleen voor 45 min en vervolgens gefixeerd en aangekleurd voor totale Lck. Figuur 2. CD4 + T-cellen werden op dubbellaags met gp120 en ICAM-1 of ICAM-1 alleen 45 minuten en vervolgens gefixeerd en gekleurd pLck (Y394). Figuur 3. CD4 + T-cellen werden op dubbellagen met gp120 en ICAM-1 of ICAM-1 alleen voor 45 min en vervolgens gefixeerd en aangekleurd voor totale Fyn.