Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

1. LNA sondas y diseño experimental Diseño de sondas LNA que son el complemento reverso de su sRNA transcripción / ARNm o hacer diseño personalizado en www.exiqon.com . Si se utiliza la opción de diseño personalizado, se conoce la secuencia, pero no el patrón de presión LNA. La adición de cada residuo LNA en un ADN o ARN resultados de oligonucleótidos en un aumento de la T m de entre dos y 10 ° C durante un dúplex de hibridación LNA-ARN 14. Lo ideal sería que las sondas LNA diseñado debe ser entre 20 a 25 nucleótidos de longitud (ya las sondas son más difíciles de sintetizar) y tiene un T m de entre 85-90 º C para el ARN de hibridación. Después de diseñar la secuencia, el uso de BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi o comparar la secuencia de la sonda a su base de datos local para asegurarse de la sonda es específica sólo para su sRNA / ARNm de interés. Al pedir la sonda de LNA, añade una modificación de biotina-TEG al extremo 5 'de los oligonucleótidos de LNA. La biotinilación es necesario para la tinción de post-hibridación con un conjugado de estreptavidina-dye. Es posible añadir esta modificación para el extremo 3 'si es necesario, pero la adición al extremo 5' es menos costosa y debería resultar en mayores rendimientos. Tres controles negativos deben ser incluidos en el método: (i) un 'no LNA "control en el que una sonda LNA no se agrega durante el paso de hibridación, (ii) un control" ningún tinte "en el que la sonda se hibrida LNA a la sRNA objetivo, pero el caso de la hibridación no se detecta debido a la ausencia de la tinción fluorescente, y el control (iii) 'ARNm no expresado sRNA /' a que utiliza una sonda de LNA que se dirige a un sRNA no existen o no expresado, con el fin de para vigilar el cumplimiento específico de la hibridación. La sonda específica LNA aquí es complementaria a la CsrB sRNA y tiene la secuencia 5'-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(monómeros LNA enletras mayúsculas). Tras la recepción de liofilizado LNA, resuspender con agua libre de nucleasa a 50 mg / ml y almacenar en el 10-20 alícuotas a -20 ° C. Soluciones 8% paraformaldehído (PFA), 10% de ácido acético en PBS: Mezclar 1 ml de 32% de PFA, 400 de ácido acético l, 400 l de 10X PBS, pH = 7,4, y 2,2 mL de agua libre de nucleasa. De alícuotas congeladas, congelar en alícuotas de un solo uso a -20 ° C sin ácido acético. 60% de solución de sulfato de dextrano: añadir 6,0 g de sulfato de dextrano a un tubo de 50 ml y añadir agua hasta un volumen final de 10 ml. Llevar esta mezcla a 65 º C en un baño de agua hasta que el sulfato de dextrano se disuelve (puede tomar 1-2 horas). Agua adicional puede ser necesario añadir en todo el proceso de solubilización de mantener un volumen de 10 ml. Alícuota del 60% de solución de sulfato de dextrano y almacenar a -20 ° C hasta su uso. 2. Fijación Cosecha de 1×10 8 células de bioluminiscentes <em> Vibrio campbellii o la bacteria de interés y transferirlos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta cantidad de células proporciona suficiente material de partida para cuatro peces de flujo de las muestras (una muestra específica de la sonda LNA y tres controles negativos). Adicional de 1,5 ml alícuotas de tubo de microcentrífuga se deben recoger si otros sRNA / ARNm especies necesitan ser probados. Que sedimenten las células bacterianas por centrifugación a 2300 xg durante cinco minutos. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender las células en 400 l de PBS 1X. A esta mezcla, añadir 400 l de un 8% paraformaldehído (PFA) y el 10% de ácido acético en solución salina tamponada con fosfato 1X (1X PBS), mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 25 ° C la mezcla una vez después de cinco minutos. Todas las incubaciones, a menos que se indique lo contrario, se llevan a cabo en un soporte de tubo se calienta. La solución de PFA deben estar preparados frescos o usado de alícuotas congeladas después de la adición de ácido acético. Paraformaldehído es un fijador de reticulación que hELPS para preservar la morfología celular y conservar el ARN intracelular. Que sedimenten las células de esta mezcla por centrifugación a 4500 xg durante dos minutos y retirar el sobrenadante con pipeta. Todos los pasos futuros que requieren centrifugación debe utilizar la misma configuración (7K, 2 min). Es importante señalar que después de la centrifugación los sobrenadantes se debe quitar con la pipeta y la decantación no. Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X y volver a suspender el final de pellet de células en 400 l de PBS 1X. Las células están fijas y se pueden almacenar a 4 ° C en 400 l de PBS 1X durante un máximo de siete días. 3. Dietil tratamiento pirocarbonato Prepare 400 l de una solución al 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC) en 1X PBS (400 l de esta solución es necesaria para cada muestra a analizar para la escala en consecuencia). La solución de DEPC debe estar recién a partir de un stock DEPC. Tratamiento con DEPC inactiva las RNasas por carbetoxilación y disminuye laseñal de fondo. Añadir 400 l de la solución al 0,1% DEPC a cada muestra de células bacterianas fija y mezclar bien con la pipeta. Incubar la mezcla a 25 º C durante 12 minutos. Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. 4. Permeabilización Añadir 1,0 mg de lisozima a 1 ml de Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) para un 1,0 mg / ml solución. Esta solución debe prepararse fresca. Añadir 800 l de 1 mg / ml solución de lisozima a las células, mezclar bien con la pipeta e incubar a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. La lisozima actúa como un reactivo de permeabilización por hidrólisis de la presente peptidoglicano de la pared celular bacteriana. Prepare un 3,0 mg / ml solución de proteinasa K en buffer TE. Esta solución debe prepararse fresca de un 20 acciones mg / ml de proteinasa K que se almacena a -20 ° C.Proteinasa K es una serina proteasa que digiere una variedad de proteínas y ayuda a la accesibilidad de las sondas y reactivos para el ARN. Añadir 800 l de 3,0 mg / ml de proteinasa K solución para el pellet de células, y mezclar bien con la pipeta. Se incuba a 25 ° C durante 15 minutos con agitación la mitad de la incubación. Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y se lavan las células una vez con 400 l de PBS 1X. Después de retirar el sobrenadante de lavado, resuspender las células en 400 l de PBS 1X y añadir 100 ml de la resuspensión en cuatro nuevos tubos de 1,5 mL microcentrífuga. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. 5. Hibridación La preparación de 100 l de buffer de hibridación (HB) para cada muestra. La HB se compone de 50% de formamida en volumen, 10% de sulfato de dextrano en masa (añadir 16,7 l de la solución de sulfato de dextrano 60% por cada l 100), solución 1X de Denhardt, sodio 50 mM de fosfato de pH 7,0,Citrato de sodio 2X (SSC), 20 ug de ADN de esperma de salmón cortado (SSSD) y 20 g de levadura tRNA. Cada uno de los componentes de la HB tiene un propósito diferente. Formamida baja la temperatura de fusión del ácido nucleico dúplex facilitando así la desnaturalización del ARN y minimizar el daño celular. Sulfato de dextrano se usa como un volumen, excluidos los polímeros para concentrar la investigación y aumentar la tasa de hibridación. Solución Denhardts, tRNA de levadura y SSSD servir como agentes bloqueantes para reducir la unión no específica. En cada una de las células que contienen la resuspensión 1,5 tubos de microcentrífuga ml, agregar 95 l HB y 5,0 l de la sRNA / ARNm específicos LNA [20 pmol de concentración específicos LNA final] o el agua (para el control LNA no negativo). Por ejemplo: Tubo de 1 a 95 l HB + 5.0 sRNA l / ARNm específicos de la sonda Tubo de 2 a 95 l HB + 5.0 l sRNA / ARNm específicos de la sonda (control negativo "ningún tinte") Tubo de 3 a 95 l HB + sRNA 5,0 l/ ARNm de la sonda ('no expresado sRNA / ARNm "control negativo) Tubo de 4 a 95 l HB + 5,0 l de agua (control negativo "no LNA) Incubar las cuatro muestras a 60 ° C durante 60 minutos. La temperatura de hibridación depende de la LNA sonda m (s) T y debe ser, aproximadamente, a 30 ° C por debajo de la predicción de T m para el recocido de RNA. Tanto la temperatura de hibridación elevada y formamida en el HB asegura la desnaturalización de la estructura secundaria de la sRNA o ARNm de interés. 6. Hibridación posterior a la lava Tras la hibridación, agregar 1,0 ml 0.1X SSC con el 0,1% Tween-20 (SSCT) a la mezcla de hibridación. Esto es necesario para permitir que las células se retira de la solución de hibridación viscoso. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Añadir 200 l de formamida al 50%, 2X SSC, 0,1% de Tween-20 a los gránulos de las células, mezclar bien y incubcomió durante 30 minutos a 65 ° C en un calentador. Añadir 1 mL 0.1X SSCT a la mezcla, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Añadir 500 SSCT 0.1X l para volver a suspender las células y se incuba durante 40 minutos a 65 ° C en un bloque de calor. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. 7. El bloqueo y la tinción Preparar el tampón de bloqueo (BB) y la solución de tinción estreptavidina-dye. Prepare una solución 1X BB de una reserva de 5 veces (disponible en el mercado, ver los reactivos). Por cada juego de cuatro tubos, preparar 1,2 mL 1X BB. Añadir 200 l 1X BB a los gránulos de las células, se resuspenden y se incuban durante 30 minutos a 25 ° C. Un tinte con estreptavidina conjugada se utiliza para detectar las sondas LNA biotina. Si bien el bloqueo, prepare una solución de 2 mg / ml DyLight estreptavidina 488 o el tinte deseado-estreptavidina conjugada en 1X BB durante 30 minutos (para tres muestras, hacer 300 L). Después de incubción con 1X BB, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de la solución de estreptavidina-colorante a la celda de pellets, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control "ningún tinte", se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente. Para el resto del protocolo, proteger los tubos de la luz con papel de aluminio. Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l de PBS 1X con 0,1% Tween-20 (PBST). Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Después de la inicial de estreptavidina conjugada manchas, la señal se amplifica mediante la introducción de un anti-biotina estreptavidina anticuerpo al conjugado estreptavidina-dye y manchas por segunda vez con la estreptavidina-dye lo que aumenta la salida de la señal por hibridación LNA de la sonda (Figura 2) . Añadir 100 ml de 1 mg / ml anti-biotina estreptavidina anticuerpos en PBS 1X, resuspend las células y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y lavar dos veces con 400 l 1X PBST. Añadir 50 l de los dos mg / ml de estreptavidina-dye solución a las células, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control "ningún tinte", se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente. Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l 1X PBST. Resuspender las células en 200 l 1X PBST y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para el análisis de citometría de flujo. Para los más pequeños de células bacterianas establecer la velocidad de flujo para reducir para reducir el tamaño del núcleo. Además, para los citómetros de flujo hacia adelante con cortes de dispersión límite, el límite debe establecerse lo más bajo posible para asegurar que las células bacterianas se detectan pequeñas. Para DyLight 488 de detección, el citómetro de flujo debe estar equipado con un láser de 488 nm y la norma de emisionesfiltros para FITC. Por lo menos 2×10 4 eventos se deben recoger. Por razones de compatibilidad con citómetros de flujo equipados con láseres diferentes, otros estreptavidina conjugada con fluoróforos se pueden utilizar para este protocolo. 8. Los resultados representativos Un ejemplo de las células que son fijos y permeabilized efectivamente se muestra en el diagrama de flujo de citometría de punto en la Figura 3. Al utilizar las condiciones descritas anteriormente para la permeabilización de la población celular es pequeño y homogéneo que indica algunos agregados de células. Cuando más alto (5 mg / ml), las concentraciones de lisozima se utilizan, las células son más propensas a agregar y mostrar un aumento de los valores de dispersión hacia adelante, indicativo de las partículas más grandes (Figura 3B). Un ejemplo de los datos de citometría de flujo de una exitosa LNA flujo PESCADO experimento se muestra en la Figura 4. El histograma muestra la detección específica de un sRNA objetivo, junto con tres controles negativos.El control negativo "ningún tinte" produce la menor fluorescencia, seguido por el 'no LNA "y" no expresado sRNA "controles negativos. Finalmente, la muestra con la sonda específica de sRNA LNA produce la mayor fluorescencia. Una vez que el método y las sondas LNA son validados de esta manera, experimentos adicionales pueden ser diseñados para monitorear los cambios en la señal de sRNA lo largo del tiempo, en respuesta a las mutaciones o diversas condiciones culturales, etc Figura 1. Representación de la estructura general de un LNA de flujo PESCADO experimento para la detección de sRNA bacteriana. Figura 2. Tinción y amplificación de la LNA flujo PESCADO señal. a) La hibridación de la sonda biotinilada LNA. b) La tinción fluorescente con la DyLight 488 conjugado de estreptavidina. c) La unión de la biotina anti-streptavidin anticuerpos contra la estreptavidina DyLight 488. El anticuerpo puede unirse estreptavidina través de su sitio de unión al antígeno o puede estar sujeto a través de sus residuos estreptavidina biotina. d) La amplificación de la señal mediante la tinción fluorescente con la más DyLight 488 conjugado de estreptavidina. Figura 3. Flow que muestra gráficos de puntos de citometría de avance frente a los resultados de una dispersión lateral) 1 mg / ml de lisozima, g 3 / ml de proteinasa K permeabilización y b) 5 mg / ml de lisozima, 3 mg / ml de proteinasa K permeabilización. Figura 4. Histograma análisis de la LNA PESCADO flujo de los resultados. La señal fluorescente generada a partir de cada muestra se muestra en las cuatro trazas: negro – sRNA específicos LNA sonda, rojo – control negativo "no expresa sRNA; azul – control negativo" no LNA; púrpura -Control negativo "ningún tinte.