Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

1. LNA-Sonden und experimentelles Design Design-LNA-Sonden, die die umgekehrte Ergänzung Ihres transkribiert sRNA / mRNA sind oder sie an kundenspezifische www.exiqon.com . Wenn Sie die benutzerdefinierte Design-Option, werden Sie wissen, die Reihenfolge, nicht aber die LNA spiking Muster. Die Zugabe von jeweils LNA Rückstand in eine DNA-oder RNA-Oligonukleotid führt zu einem Anstieg in T m zwischen zwei und 10 ° C für eine LNA-RNA-Hybridisierung Duplex-14. Idealerweise sollte die entworfen LNA-Sonden zwischen 20-25 Nukleotide lang (länger Sonden sind schwieriger zu synthetisieren) sein und eine T m zwischen 85-90 ° C für die RNA-Hybridisierung. Nach dem Entwurf der Sequenz verwenden BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi oder vergleichen Sie die Sondensequenz auf Ihre lokale Datenbank, um sicherzustellen, wird die Sonde spezifisch nur auf Ihre sRNA / mRNA des Interesses. Bei der Bestellung der LNA-Sonde, fügen Sie ein Biotin-TEG Modifikation der 5 'Ende der LNA-Oligonukleotid. Die Biotinylierung ist notwendig für Post-Hybridisierung Färbung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat. Es ist möglich, diese Modifikation zu den 3 Add 'end if notwendig, aber die zusätzlich zu den 5' Ende ist weniger teuer und sollte in höheren Ausbeuten führen. Drei negative Kontrollen sollten in das Verfahren einbezogen werden: (i) a 'no LNA' control, in dem ein LNA-Sonde nicht während der Hybridisierung wird hinzugefügt, (ii) ein "Nein Farbstoff der Kontrolle, in dem der LNA-Sonde ist es, die hybridisierten Ziel sRNA aber die Hybridisierung Veranstaltung ist nicht durch das Fehlen des fluoreszierenden Fleck, erkannt und (iii) ein "Nicht-Ausdruck sRNA / mRNA-Steuerelement, das ein LNA-Sonde, die eine nicht vorhandene oder nicht ausgedrückt sRNA, um Ziele nutzt Nicht-spezifische Hybridisierung zu überwachen. Die spezifischen LNA-Sonde hier ist komplementär zu den sRNA CsrB und hat die Sequenz 5'-Biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA Monomeren inGroßbuchstaben). Nach Erhalt der lyophilisierten LNA, mit Nuklease-freiem Wasser auf 50 pg / mL und speichern resuspendieren in 10-20 ul Aliquots bei -20 ° C. Lösungen 8% paraformaldehye (PFA), 10% Essigsäure in PBS: Mix 1 mL 32% pfa, 400 ul Essigsäure, 400 ul 10X PBS, pH = 7,4 und 2,2 ml Nuklease-freies Wasser. Für gefrorenen Aliquots, in einmaligen Gebrauch bei -20 ° C ohne Essigsäure einfrieren. 60% Dextransulfat-Lösung: add 6,0 ​​g Dextransulfat zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 mL. Hitze dieses Gemisch auf 65 ° C in einem Wasserbad, bis die Dextransulfat gelöst ist (konnte 1-2 Stunden dauern). Zusätzliches Wasser Möglicherweise müssen Sie während der Solubilisierung hinzugefügt werden, um eine 10 ml Volumen zu erhalten. Aliquot der 60% Dextransulfat-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung. 2. Fixierung Ernte 1×10 8 Zellen der Biolumineszenz <em> Vibrio campbellii oder Ihre Bakterien von Interesse und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Diese Menge von Zellen bietet genügend Ausgangsmaterial für vier Flow-FISH-Proben (eine bestimmte LNA-Sonde Probe und drei negative Kontrollen). Zusätzliche 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots sollten dann erhoben, wenn andere sRNA / mRNA-Spezies getestet werden müssen. Pellet die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2300 xg für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, und Zellen in 400 ul 1X PBS. Zu dieser Mischung werden 400 ul einer 8% paraformaldehye (pfa) und 10% Essigsäure in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1X PBS), gut mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 25 ° C Mischen einmal nach fünf Minuten. Alle Inkubationen, sofern nicht anders angegeben, sind in einem beheizten Rohr Halter durchgeführt. Die pfa Lösung sollte frisch zubereitet werden oder verwendet werden von gefrorenen Aliquots nach der Zugabe von Essigsäure. Paraformaldehyd ist ein Vernetzer Fixativ, dass hELPS zu bewahren Zellmorphologie und behalten intrazellulären RNA. Pellet die Zellen aus diesem Gemisch durch Zentrifugation bei 4500 xg für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Alle künftigen Schritte, die Zentrifugation benötigen, sollten die gleichen Einstellungen (7K, 2 min). Es ist wichtig, dass nach Zentrifugation beachten Sie die Überstände durch Pipettieren und Dekantieren nicht entfernt werden sollte. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS resuspendieren und die endgültige Zellpellet in 400 ul 1X PBS. Die Zellen sind nun behoben und kann bei 4 ° C in 400 ul 1X PBS für bis zu sieben Tage gelagert werden. 3. Diethylpyrocarbonat Behandlung Bereiten Sie 400 ul einer 0,1% igen Lösung von Diethyl-(DEPC) in 1X PBS (400 ul dieser Lösung ist für jede zu untersuchende Probe so Skala entsprechend werden benötigt). Die DEPC-Lösung sollte frisch zubereitet von einem DEPC Lager sein. DEPC-Behandlung inaktiviert RNasen durch carbethoxylation und verringert dieHintergrund-Signal. Zugabe von 400 ul der 0,1% DEPC-Lösung in jede feste Bakterienzelle Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren dieser Mischung bei 25 ° C für 12 Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. 4. Permeabilisierung Add 1,0 mg Lysozym auf 1 ml Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) für eine 1,0 mg / ml Lösung. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden. Add 800 ul der 1 mg / mL Lysozym-Lösung zu den Zellen, mischen durch Pipettieren und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Lysozym wirkt als Permeabilisierung Reagenz durch Hydrolyse der Peptidoglycan in bakteriellen Zellwänden. Bereiten Sie eine 3,0 pg / ml-Lösung von Proteinase K in TE-Puffer. Diese Lösung sollte hergestellt aus einer 20 mg / ml Proteinase K Aktie, die bei -20 ° C gelagert wird frischProteinase K ist eine Serin-Protease, die eine Vielzahl von Proteinen verdaut und hilft die Zugänglichkeit der Sonden und Reagenzien an die RNA. Add 800 ul des 3,0 ug / ml Proteinase K-Lösung auf das Zellpellet und gründlich durch Pipettieren. Inkubation bei 25 ° C für 15 Minuten mit Vortexen auf halbem Weg durch die Inkubation. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und die Zellen werden einmal mit 400 ul 1X PBS. Nach dem Entfernen der Wäsche Überstand, die Zellen in 400 ul 1X PBS und 100 ul der Resuspension in vier neue 1,5 ml Reaktionsgefäße. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. 5. Hybridisierung Bereiten Sie 100 ul Hybridisierungspuffer (HB) für jede Probe. Das HB ist von 50% Formamid nach Volumen, 10% Dextransulfat Masse (add 16,7 ul der 60% Dextransulfat-Lösung für alle 100 ul), 1X Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 gestellt,2X Natriumcitrat (SSC), 20 ug gescherte Lachssperma-DNA (SSSD) und 20 ug Hefe-tRNA. Jede der Komponenten des HB hat einen anderen Zweck. Formamid senkt die Schmelztemperatur von Nukleinsäureduplexe dabei helfen, mit Denaturierung der RNA und die Minimierung von Zellschäden. Dextransulfat ist als Volumen-ohne Polymer, um die Sonde zu konzentrieren und steigern die Hybridisierung Rate verwendet. Denhardts Lösung, Hefe-tRNA und SSSD als Blocker dienen, um unspezifische Bindung zu reduzieren. In jedem der Zelle Resuspension-Gehalt von 1,5 mL Reaktionsgefäße, fügen Sie 95 ul HB und 5,0 ul der sRNA / mRNA-spezifische LNA [20 pmol der spezifischen LNA Endkonzentration] oder Wasser (für die keine LNA Negativ-Kontrolle). Zum Beispiel: Rohr 1 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifische Sonde Rohr 2 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifischen Sonde ("kein Farbstoff" Negativ-Kontrolle) U-Bahn 3 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA/ MRNA-Sonde ("non-Ausdruck sRNA / mRNA" Negativ-Kontrolle) Rohr 4 bis 95 ul HB + 5,0 ul Wasser ('no LNA "Negativ-Kontrolle) Inkubieren Sie alle vier Proben bei 60 ° C für 60 Minuten. Die Hybridisierung ist abhängig von der LNA-Sonde (n) T m und sollte bei ca. 30 ° C eingestellt werden unterhalb der prognostizierten T m für die RNA-Glühen. Sowohl die erhöhte Hybridisierungstemperatur und Formamid im HB sorgt für die Denaturierung von Sekundärstruktur des sRNA oder mRNA des Interesses. 6. Post-Hybridisierung wäscht Nach der Hybridisierung 1,0 ml 0,1 × SSC mit 0,1% Tween-20 (SSCT), um die Hybridisierung Mischung. Dies ist notwendig, damit die Zellen aus der zähen Hybridisierungslösung entfernt werden. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Geben Sie 200 ul von 50% Formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20, die Zellpellets, gründlich mischen und incubaß für 30 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. 1 ml 0,1 × SSCT auf die Mischung, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Add 500 ul 0,1 X SSCT, um die Zellen zu resuspendieren, Inkubation für 40 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. 7. Blocking und Färbung Bereiten Sie die Blocking-Puffer (BB) und die Streptavidin-Farbstoff-Färbelösung. Bereiten Sie eine 1X BB-Lösung aus einer 5fach-Aktie (im Handel erhältlich, siehe Reagenzien). Für jede Gruppe von vier Röhren, bereiten 1,2 ml 1X BB. Geben Sie 200 ul 1X BB auf die Zellpellets, resuspendieren und Inkubation für 30 Minuten bei 25 ° C. Ein Streptavidin-konjugierten Farbstoff wird verwendet, um die biotinylierten LNA-Sonden erkennen. Während blockieren, bereiten eine Lösung von 2 pg / mL DyLight 488 Streptavidin oder die gewünschte Farbstoff-Streptavidin-Konjugat in 1X BB für 30 min (für drei Proben, machen 300 ul). Nach incubarbeit mit 1X BB-, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Dann werden 50 ul der Streptavidin-Farbstoff-Lösung, die Zellpellets, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die "keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. Für den Rest des Protokolls zum Schutz der Rohre von Licht mit Aluminiumfolie. Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Nach der ersten Streptavidin-Konjugat-Färbung, wird das Signal durch die Einführung eines biotinylierten Anti-Streptavidin Antikörpers an die Streptavidin-Farbstoff-Konjugat und dann Färbung ein zweites Mal mit dem Streptavidin-Farbstoff erhöht so die Signalausgabe pro hybridisierte LNA-Sonde (Abbildung 2) verstärkt . Geben Sie 100 ul von 1 pg / mL biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörper in 1X PBS, resuspend die Zellen, und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und waschen zweimal mit 400 ul 1X PBST. Dann werden 50 ul der 2 pg / mL Streptavidin-Farbstoff-Lösung zu den Zellen, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die "keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBST. Resuspendieren der Zellen in 200 ul 1X PBST und lagern bei 4 ° C, bis sie zur Durchflusszytometrie. Für kleinere Bakterienzellen stellen Sie den Durchfluss zu langsam, um den Kern verkleinern. Darüber hinaus ist für Durchflusszytometer mit Vorwärtsstreuung Schwelle Abschaltungen, muss die Grenzfrequenz so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen erkannt werden. Für DyLight 488 Erkennung, sollte das Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser-und Standard-Emission ausgestattet werdenFilter für FITC. Mindestens 2×10 4 Ereignisse gesammelt werden sollten. Um die Kompatibilität mit Durchflusszytometer mit verschiedenen Lasern ausgestattet ist, können andere Streptavidin-konjugierte Fluorophore für dieses Protokoll verwendet werden. 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Zellen, die fixiert und permeabilisiert effektiv in der Durchflusszytometrie Dot-Plot in Abbildung 3A gezeigt. Bei Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen zur Permeabilisierung ist die Zellpopulation kleine und homogene zeigt einige Zellaggregate. Bei höheren (5 mg / ml) Konzentrationen von Lysozym verwendet werden, werden die Zellen mit größerer Wahrscheinlichkeit zu aggregieren und zu zeigen erhöhte Vorwärtsstreuung Werte indikativ für größere Partikel (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten aus einer erfolgreichen LNA Flow-FISH Experiment ist in Abbildung 4 dargestellt. Das Histogramm zeigt die spezifische Detektion eines Targets sRNA zusammen mit drei negativen Kontrollen.Die "keinen Farbstoff" Negativ-Kontrolle produziert am wenigsten Fluoreszenz, die von der 'no LNA "und" non-Ausdruck sRNA "negativen Kontrollen folgen. Schließlich erzeugt der Probe mit dem sRNA-spezifische LNA-Sonde der größte Fluoreszenz. Sobald die Methode und LNA-Sonden auf diese Weise validiert sind, können zusätzliche Experimente entwickelt, um Veränderungen in der sRNA Signals über die Zeit zu überwachen, in Reaktion auf Mutationen oder vielfältige Kultur Bedingungen, etc. Abbildung 1. Darstellung des Gesamtkonzepts eines LNA Flow-FISH Experiment zum Nachweis von bakteriellen sRNA. Abbildung 2. Färbung und Verstärkung des LNA Flow-FISH-Signal. a) Hybridisierung der biotinylierten LNA-Sonde. b) Färbung mit dem fluoreszierenden DyLight 488 Streptavidinkonjugat. c) Die Bindung des biotinylierten anti-streptavidin Antikörpers an die DyLight 488 Streptavidin. Der Antikörper kann Streptavidin durch seine Antigen-Bindungsstelle binden oder durch Streptavidin durch seine Biotin-Reste gebunden zu sein. d) Verstärkung des Signals durch weitere Färbung mit dem Fluoreszenz-DyLight 488 Streptavidinkonjugat. Abbildung 3. Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen uns gegenüber side scatter Ergebnisse für a) 1 mg / mL Lysozym, 3 pg / mL Proteinase K Permeabilisierung und b) 5 mg / ml Lysozym, 3 pg / ml Proteinase K Permeabilisierung. Abbildung 4. Histogramm Analyse der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Das Fluoreszenzsignal von jeder Probe erzeugt wird durch die vier Spuren gezeigt: schwarz – sRNA-spezifische LNA-Sonde, rot – "nicht zum Ausdruck sRNA" negative Kontrolle; blau – 'no LNA "negative Kontrolle; purple -'Keinen Farbstoff "negative Kontrolle.