Un roman à haut débit méthode est décrite qui permet la détection et la quantification relative de petit ARN et d'expression d'ARNm à partir des cellules bactériennes simples en utilisant des sondes d'acides nucléiques verrouillés et cytométrie en flux par fluorescence-<em> In situ</emL'hybridation>.
L'hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique puissante qui est utilisée pour détecter et localiser des séquences spécifiques d'acide nucléique dans l'environnement cellulaire. Afin d'augmenter le débit, le poisson peut être combinée avec la cytométrie de flux (flow-FISH) pour permettre la détection de séquences d'acide nucléique cible dans des milliers de cellules individuelles. En conséquence, le débit-FISH propose un net avantage sur lysat / ensemble basée sur des méthodes de détection des acides nucléiques, car chaque cellule est traitée comme une observation indépendante, permettant ainsi des analyses statistiques plus fort et la variance. Ces attributs ont incité l'utilisation de méthodes de FISH et de débit-FISH dans un certain nombre de différentes applications et l'utilité de ces méthodes a été démontrée avec succès dans la détermination de la longueur des télomères 1,2, l'identification cellulaire et l'expression du gène 3,4, suivi de la multiplication virale 5 cellules infectées, et l'analyse des communautés bactériennes et le dénombrement6.
Traditionnellement, la spécificité des méthodes de FISH et écoulement du poisson a été communiquée par les sondes d'oligonucléotides d'ADN. Récemment toutefois, le remplacement des sondes oligonucléotidiques d'ADN avec des analogues d'acides nucléiques comme sondes FISH et flux de poissons a augmenté à la fois la sensibilité et la spécificité de chaque technique en raison de la température de fusion élevée (T m) de ces analogues pour les acides nucléiques naturels 7,8 . D'acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes sont un type de analogiques acide nucléique qui contiennent les nucléotides LNA pointes à travers une séquence d'ADN ou d'ARN 9,10. Couplé avec un débit-FISH, sondes LNA ont été précédemment montré à surperformer les sondes d'ADN conventionnelles 7,11 et ont été utilisés avec succès pour détecter l'ARNm eucaryotes 12 et l'ARN viral dans les cellules de mammifères 5.
Ici nous étendre cette capacité et décrire un LNA flux POISSONS méthode qui permet la détection spécifique de l'ARN dans la cellule bactériennes (figure 1). Plus précisément, nous nous intéressons à la détection de petits non-codant l'ARN de régulation (SRNA) qui ont remporté un intérêt considérable dans les dernières années car ils ont été trouvés pour servir les principaux éléments de la réglementation dans de nombreux processus cellulaires critiques 13. Cependant, il existe des outils limités pour étudier les défis et les petits ARN de détecter petit ARN dans les cellules bactériennes est due en partie à la taille relativement faible (typiquement 50 à 300 nucléotides de long) et la faible abondance de molécules d'ARNs ainsi que la difficulté générale à travailler avec de plus petites cellules biologiques avec plus ou moins les membranes cellulaires. Dans cette méthode, nous décrivons les conditions de fixation et permeabilzation qui préservent la structure des cellules bactériennes et permettre la pénétration des sondes LNA ainsi que les étapes d'amplification du signal qui permettent la détection spécifique de faible abondance Srna (figure 2).
Le flux de LNA-FISH méthode présentée ici a été utilisé pour détecter l'expression d'un petit ARN de la Gram-négatif bactérie marine Vibrio campbellii dont l'expression a déjà été confirmée par le profil d'expression basé sur un microréseau et inverser la réaction en chaîne par polymérase après transcription 16. À ce jour, nous avons utilisé cette méthode pour contrôler l'expression d'une variété d'ARN (par exemple trans-encodé Srna, petit ARN qui modulent l'activité des protéines, riboswitches et ARNm). En tant que tel, nous sommes convaincus que la méthode est adaptable et peut être utilisé pour détecter une cible petit ARN ou ARNm et peut être modifié pour être utilisé dans toutes les espèces bactériennes ou type de cellule. Si la modification de ce protocole est nécessaire pour d'autres types cellulaires, la variable la plus importante à considérer la manipulation est l'étape de perméabilisation. Par exemple, lors de la modification des conditions de perméabilisation décrit ici, les changements dans les concentrations de lysozyme et la protéinase K doit être testé. Nous avons constaté que doubler outripler la quantité de lysozyme et la protéinase K ont entraîné des changements majeurs dans les flux de LNA-FISH résultats. Par ailleurs, lors du test des conditions de perméabilisation supplémentaires, les cellules doivent être analysés pour l'agglutination, la perte de cellules, et le meilleur signal obtenu au ratio de fond de fluorescence. L'étendue de l'agglutination de cellules peuvent être testés pour la microscopie et / ou la cytométrie de flux. Par cytométrie en flux, amas cellulaires sont présents que dans une queue avant vs dot plot côté de dispersion et la méthode de perméabilisation correct de minimiser cet effet de résidus. Cette méthode est également prête à la détection de petit ARN multiplex, sans modifications majeures au protocole décrit comme complémentaires des sondes LNA étiquetés avec des haptènes tels que la digoxigénine pourrait être ajouté lors de l'étape d'hybridation puis détecté avec un anticorps anti-digoxigénine et secondaires d'anticorps fluorophore conjugué. Actuellement, la seule limitation que nous avons rencontrés avec cette méthode est son incapacité à générer un signal suffisamment de faiblement exespèces petit ARN pressées et des efforts sont en cours pour déterminer le seuil de détection (en nombre de copies par cellule absolue).
Globalement, les flux de LNA-FISH méthode fournit l'occasion de mesurer petit ARN bactérien ou l'expression des ARNm au niveau des cellules simples de façon à haut débit pour fournir des indications sur la présence et l'abondance relative d'une espèce SRNA et la mesure dans laquelle son expression varie dans une population.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Office of Naval Research des États-Unis via des fonds de recherche navale coeur de laboratoire.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems/Ambion | AM9625 | |
Nuclease-free water | Applied Biosystems/Ambion | AM9932 | (not DEPC treated) |
32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L2879 | |
Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems/Ambion | AM2546 | |
Formamide | Applied Biosystems/Ambion | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems/Ambion | AM9770 | |
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems/Ambion | AM9680 | Aliquot and freeze |
Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies/Invitrogen | 15401-011 | Aliquot and freeze |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |