Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК

1. МШУ зондов и опытно-конструкторских Дизайн МШУ зондов, которые обратном дополнением вашей транскрипции р-РНК / РНК или их специально созданных на www.exiqon.com . Если вы используете нестандартный дизайн, вы будете знать, последовательности, но не образец МШУ пики. Добавление каждого остатка МШУ в ДНК или РНК олигонуклеотид приводит к увеличению Т м от двух до 10 ° С для МШУ-РНК гибридизации дуплекс 14. В идеале, предназначен зондов МШУ должна быть в пределах 20-25 нуклеотидов в длину (более длинные зонды являются более трудными для синтеза) и Т м между 85-90 ° C для РНК-гибридизации. После разработки последовательности, используйте BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi или сравнивать последовательности зонда к локальной базе данных для обеспечения зонд, характерные только для вашего р-РНК / мРНК интересов. При заказе зонд МШУ, добавляют биотин-TEG модификации до конца 5 'олигонуклеотидных МШУ. Биотинилирование необходимо для пост-гибридизация окрашивания стрептавидин-конъюгированных с красителем. Можно добавить эту модификацию 3 'конец, если необходимо, но дополнение к 5' концу дешевле и должно привести к повышению урожайности. Три отрицательного контроля должны быть включены в метод: (я) контроль »не МШУ", в котором зонд МШУ не добавляется во время гибридизации шаг, (II) управление "нет красителей", в котором зонд МШУ гибридизации с целевой р-РНК, но гибридизации событие не обнаружены из-за отсутствия флуоресцентные пятна, и контроль (III) "не выразил р-РНК / мРНК ', которая использует датчик МШУ, что цели не существуют, либо не-р-РНК выражены в порядке для контроля неспецифической гибридизации. Конкретные зонд МШУ здесь является дополнением к рРНК CsrB и последовательность 5'-биотин-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA мономеров взаглавные буквы). После получения лиофилизированного МШУ, ресуспендируют с нуклеазы без воды до 50 мкг / мл и хранят в 10-20 мкл аликвоты при -20 ° C. Решения 8% paraformaldehye (PFA), 10% уксусной кислоты в PBS: Смешайте 1 мл 32% PFA, 400 мкл уксусной кислоты, 400 мкл 10X PBS, рН = 7,4 и 2,2 мл нуклеазы без воды. Для замороженные порции, заморозить в одной порции использовать при температуре -20 ° С без уксусной кислоты. 60% декстран сульфата решение: добавить 6,0 г декстрана сульфата 50 мл коническую пробирку и добавляют воду до конечного объема 10 мл. Тепло этой смеси до 65 ° С на водяной бане до сульфата декстрана растворяется (может занять 1-2 ч). Дополнительная вода может нужно добавить всей солюбилизации процесса для поддержания объема 10 мл. Алиготе 60% раствора сульфата декстрана и храните при температуре от -20 ° C до использования. 2. Фиксация Урожай 1×10 8 ячеек биолюминесцентных <em> Vibrio campbellii или ваши бактерии интересов и передача их в 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Это количество клеток обеспечивает достаточно исходного материала на четыре потока-FISH образцов (один конкретный зонд МШУ образца и трех отрицательных контролей). Дополнительные 1,5 мл аликвоты микроцентрифужных трубка должна быть собрана, если другие р-РНК / мРНК видов должны быть проверены. Гранул бактериальных клеток путем центрифугирования при 2300 мкг в течение пяти минут. Удалите супернатант с помощью пипетки и ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS. К этой смеси добавить 400 мкл 8% paraformaldehye (PFA) и 10% уксусной кислоты в 1X фосфатным буферным раствором (1X PBS), решение, хорошо перемешать и инкубировать 10 минут при 25 ° C смешивания один раз через пять минут. Все инкубации, если не указано иное, выполняются в отапливаемом держателя трубки. Решение PFA должны быть готовы использовать свежие или замороженные из аликвот после добавления уксусной кислоты. Параформальдегид является сшивание фиксатором, что чelps сохранить морфологии клетки и сохраняют внутриклеточных РНК. Гранул клетки из этой смеси путем центрифугирования при 4500 мкг в течение двух минут и удалить супернатант с помощью пипетки. Все последующие шаги, которые требуют центрифугирования следует использовать те же настройки (7К, 2 мин). Важно отметить, что после центрифугирования надосадочную жидкость должна быть удалена с помощью пипетки, а не переливание. Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS и ресуспендируют окончательный осадок клеток в 400 мкл 1X PBS. Клетки исправлено и может храниться при температуре 4 ° С в 400 мкл 1X PBS на срок до семи дней. 3. Диэтиловый pyrocarbonate лечения Подготовка 400 мкл 0,1% раствора диэтилового pyrocarbonate (DEPC) в 1X PBS (400 мкл этого раствора необходимо для каждого образца для тестирования столь масштабного соответственно). DEPC решения должны быть подготовлены только что из DEPC акций. DEPC лечения инактивирует РНКаз по carbethoxylation и уменьшаетсяфонового сигнала. Добавить 400 мкл 0,1% DEPC решение каждого фиксированного бактериальные образцы клеток и хорошо перемешать с помощью пипетки. Выдержите эту смесь при температуре 25 ° С в течение 12 минут. Вымойте клетки в два раза с 400 мкл 1X PBS, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 4. Пермеабилизации Добавить 1,0 мг лизоцима в 1 мл Трис-ЭДТА буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) на 1,0 мг / мл раствора. Это решение должно быть подготовлено свежим. Добавить 800 мкл 1 мг / мл лизоцима решение клетки, тщательно перемешать с помощью пипетки и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут при периодическом перемешивании. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Лизоцим действует как пермеабилизации реагента путем гидролиза пептидогликана присутствуют в клеточной стенки бактерий. Подготовка 3,0 мкг / мл раствора протеиназы К в буфере TE. Это решение должно быть подготовлено только что из 20 мг / мл протеиназы К акции, которая хранится при температуре -20 ° C.Протеиназы К сериновых протеаз, который переваривает различные белки и помогает доступности зондов и реагентов для РНК. Добавить 800 мкл 3,0 мкг / мл протеиназы К решению осадок клеток и тщательно перемешать с помощью пипетки. Инкубировать при температуре 25 ° С в течение 15 минут с вортексе в середине инкубации. Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и промыть клетки сразу с 400 мкл 1X PBS. После удаления надосадочной мыть, ресуспендирования клеток в 400 мкл 1X PBS и добавьте 100 мкл ресуспендирования на четыре новые пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 5. Гибридизация Подготовка по 100 мкл буфера гибридизации (HB) для каждого образца. HB состоит из 50% формамида по объему, 10% декстран сульфата по массе (добавьте 16,7 мкл 60% раствора сульфата декстрана на каждые 100 мкл), решение 1X Денхардта, 50 мМ фосфата натрия рН 7,0,2X цитрата натрия (SSC), 20 мкг стриженой ДНК спермы лосося (SSSD) и 20 мкг тРНК дрожжей. Каждый из компонентов HB имеет свое назначение. Формамид понижает температуру плавления нуклеиновых кислот дуплексы тем самым помогая с денатурации РНК и сведение к минимуму повреждения клеток. Декстран сульфат используется в качестве объема исключая полимер сосредоточиться зонда и увеличения скорости гибридизации. Denhardts решение, дрожжевой тРНК и SSSD служить блокаторы для снижения неспецифического связывания. В каждой из ячейки ресуспендирования содержащие пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных, добавить 95 мкл HB и 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных LNA [20 пмоль конкретных МШУ конечной концентрации] или воды (не МШУ отрицательный контроль). Например: Труба 1 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд Tube 2 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК / мРНК конкретных зонд (отрицательный контроль "нет красителей) Труба 3 – 95 мкл HB + 5,0 мкл р-РНК/ МРНК зонда («не выразил р-РНК / мРНК" отрицательный контроль) Труба 4 – 95 мкл HB + 5,0 мкл воды (отрицательный контроль "нет LNA) Инкубируйте всех четырех образцов при 60 ° С в течение 60 минут. Гибридизации температура зависит от LNA зонд (ы) Т м и должен быть установлен приблизительно на 30 ° С ниже предсказанных Т м для РНК отжига. Оба повышенной температуре гибридизации и формамида в НВ обеспечивает денатурации вторичная структура р-РНК, или мРНК интересов. 6. После гибридизации моет После гибридизации, добавить 1,0 мл 0.1X SSC с 0,1% Твин-20 (SSCT) для гибридизации смеси. Это необходимо, чтобы клетки должны быть удалены из вязкого раствора гибридизации. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Добавить 200 мкл 50% формамида, 2X SSC, 0,1% Твин-20 в камеру гранулы, тщательно перемешать и incubел в течение 30 минут при температуре 65 ° С в нагревательном блоке. Добавьте 1 мл 0.1X SSCT к смеси, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалить супернатант. Добавить 500 мкл 0.1X SSCT для ресуспендирования клеток и инкубировать 40 минут при 65 ° С в тепло блоку. Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. 7. Блокировка и окрашивание Подготовка блокирующего буфера (BB) и стрептавидин-красителя окрашивание раствора. Подготовка 1X решение BB от 5X акции (имеется в продаже, см. реагенты). Для каждого набора из четырех труб, подготовить 1,2 мл 1X BB. Добавить 200 мкл 1X BB к клетке гранулы, ресуспендирования и инкубировать 30 минут при 25 ° C. Стрептавидин-сопряженных красителя используется для обнаружения биотинилированного зондов МШУ. Хотя блокирование, приготовить раствор из 2 мкг / мл DyLight 488 стрептавидин или желаемый красителя стрептавидин сопряжены в 1X BB в течение 30 мин (для трех образцов, составит 300 мкл). После incubation с 1X BB, гранулы клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. Добавить 50 мкл стрептавидином раствор красителя к клетке гранулы, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только. Для остальной части протокола, защита труб от света использованием алюминиевой фольги. Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBS с 0,1% Твин-20 (PBST). Гранул клеток (7К, 2 мин) и удалите супернатант. После первоначального стрептавидин-сопряженных окрашивания, сигнал усиливается путем введения биотинилированного анти-стрептавидин антитела к стрептавидин-конъюгированных с красителем, а затем окрашивание второй раз с стрептавидином красителя таким образом увеличивая выходной сигнал в гибридизированных МШУ зонда (рис. 2) . Добавить 100 мкл 1 мкг / мл биотинилированного анти-стрептавидин антител в 1X PBS, resuspenг клеток, и инкубировать при температуре 25 ° С в течение 30 минут с редкими смешивания. Гранул клеток (7К, 2 мин), удалите супернатант и мыть два раза с 400 мкл 1X PBST. Добавить 50 мкл 2 мкг / мл стрептавидином раствор красителя в клетки, тщательно перемешать и выдержать в течение 12 минут при 25 ° С при постоянном перемешивании на вихрь или в thermomixer. Для контроля «нет красителей, добавить 50 мкл 1X блокирующего буфера только. Вымойте клетки сразу с 500 мкл буфера 0.1X SSCT и один раз с 400 мкл 1X PBST. Ресуспендируют клеток в 200 мкл 1X PBST и храните при температуре 4 ° С до готовности для анализа потока цитометрии. Для небольших бактериальных клеток набор скорости потока, чтобы замедлить снижение основных размеров. Кроме того, для потока цитометров с порога вперед отключений разброс, отсечка должен быть установлен как можно ниже, чтобы обеспечить небольшой бактериальной клетки обнаружены. Для DyLight 488 обнаружения, Проточный цитометр должен быть оснащен 488 нм лазером и стандарт излученияфильтры для FITC. По крайней мере, 2×10 4 мероприятия должны быть собраны. Для совместимости с потоком цитометров оснащены различными лазерами, другие стрептавидин-сопряженных флуорофоров могут быть использованы для этого протокола. 8. Представитель результаты Например клеток, которые являются фиксированными и проницаемыми эффективно представлена ​​на точку проточной цитометрии участок на рисунке 3А. При использовании описанных выше условиях для пермеабилизации, клеточной популяции небольшой и однородной указывает несколько агрегатов клеток. Когда выше (5 мг / мл) концентрации лизоцима используются, клетки более склонны к агрегации и показывают увеличение разброса значений вперед, что свидетельствует о более крупных частиц (рис. 3В). Пример проточной цитометрии данные из успешных МШУ поток-FISH эксперимента приведена на рисунке 4. Гистограмма показывает, специфической детекции целевых р-РНК вместе с тремя отрицательными элементами управления."Нет красителя" отрицательного контроля производит мере флуоресценции, а затем «нет МШУ» и «не-р-РНК выразил« отрицательного контроля. Наконец, образец с р-РНК конкретных МШУ зонд производит наибольшее флуоресценции. Как только метод и LNA зондов проверяются таким образом, дополнительные эксперименты могут быть разработаны для отслеживания изменений в сигнале р-РНК с течением времени, в ответ на мутации или разнообразных условиях культуры и т.д. Рисунок 1. Изображение общая схема потока МШУ-FISH эксперимент для выявления бактериальных Срна. Рисунок 2. Окрашивание и усиления МШУ поток-FISH сигнала. а) Гибридизация биотинилированного зонд МШУ. б) Окрашивание с люминесцентными DyLight 488 сопряженное стрептавидином. в) Связывание биотинилированного анти-х годовtreptavidin антитела к DyLight 488 стрептавидин. Антитела могут связываться стрептавидин через свои антиген-связывающий участок или могут быть связаны стрептавидин через биотин остатков. г) Усиление сигнала дальнейшего окрашивания флуоресцентным DyLight 488 сопряженное стрептавидином. Рисунок 3. Проточная цитометрия точка делянок вперед по сравнению с боковой разброс результатов) 1 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации и б) 5 мг / мл лизоцима, 3 мкг / мл протеиназы К пермеабилизации. Рисунок 4. Гистограмма анализ потока МШУ-FISH результаты. Флуоресцентный сигнал, генерируемый из каждого образца показывает четыре следы: черный – р-РНК конкретных МШУ зонд; красный – отрицательный контроль "не выразил р-РНК; синий – отрицательный контроль" нет МШУ; фиолетовый -Отрицательное "нет красителя« контроль.