小説ハイスループット法は、ロックされた核酸プローブとフローサイトメトリー、蛍光を用いて、単一の細菌細胞からの検出と小さなRNAとmRNA発現の相対定量を可能にすることが記載されている<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション。
蛍光 in situハイブリダイゼーション (FISH)が検出し、細胞環境内の特定の核酸配列をローカライズするために使用される強力な手法です。スループットを向上させるために、FISHは、個々の細胞の数千の標的核酸配列の検出を可能にするためにフローサイトメトリー(フロー- FISH)と組み合わせることができます。各セルは、それによってより強力な統計と分散分析を可能にする、独立した観察として扱われるため、結果として、フロー- FISHは、ライセート/アンサンブルベースの核酸の検出方法に比べて明確な利点を提供しています。これらの属性は、異なるアプリケーションの数のFISH、フロー- FISH法の使用を促していると、これらのメソッドのユーティリティが正常にウイルス増殖を監視し、テロメアの長さの決定1,2、細胞の同定と遺伝子発現3,4に示されている感染細胞5、および細菌群集の解析と列挙6。
伝統的に、FISH、フロー- FISH法の特異性はDNAのオリゴヌクレオチドプローブにより付与されています。しかし、最近、FISH、フロー- FISHプローブとしての核酸アナログによるDNAオリゴヌクレオチドプローブの交換が原因で、天然核酸7,8のためのこれらのアナログのより高い融解温度(T m)に各手法の感度と特異度の両方を増加している。ロックされた核酸(LNA)プローブは、DNAまたはRNA配列9,10を通してスパイクLNAヌクレオチドを含む核酸アナログの一種です。フロー- FISHと組み合わせることで、LNAプローブは以前に、従来のDNAプローブ7,11を上回ることが示されていると、正常5哺乳動物細胞内で真核生物のmRNAは12とウイルスRNAを検出するために使用されている。
ここでは、この機能を展開し、細菌の細胞内でRNAの特異的検出を可能にLNAフロー- FISH法を説明します。の( 図1)。具体的には、小さな非コード彼らは多くの重要な細胞プロセス13の主要な調節要素として機能するように発見されているとして、過去数年間でかなりの関心を集めている規制のRNA(sRNAを)の検出に興味を持っています。しかし、sRNAsと細菌細胞のsRNAを検出する課題を研究するために、限られたツールでは、一部の比較的小さなサイズ(通常は長さが50から300ヌクレオチド)とsRNA分子の低濃度だけでなく、作業の一般的な難しさに起因するあります細胞膜を変化させると小さな生物細胞と。この方法では、我々は細菌細胞の構造を維持し、LNAプローブの浸透だけでなく、低濃度sRNA( 図2)の特異的検出を可能にする信号増幅のステップを可能に固定し、permeabilzation条件について説明します。
ここに示すLNAフロー- FISH法は、式の前にマイクロアレイベースの発現プロファイリングと逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法16を介して確認されているグラム陰性海洋細菌ビブリオcampbelliiからsRNAの発現を検出した。これまでに、我々は分子RNA(タンパク質活性、リボスイッチ、およびmRNAを調節するなどのトランスエンコードされたsRNA、sRNA)の様々な表現を監視するために、このメソッドを使用している。このように、我々は方法が適応であり、任意のsRNAまたはmRNAターゲットを検出するために使用することができ、あらゆる細菌種や細胞タイプで使用するために変更できると確信しています。このプロトコルの変更が他の細胞型のための必要な場合は、操作に考慮すべき最も重要な変数は、透過性のステップです。例えば、ここで説明する透過処理の条件を変更するときに、リゾチームおよびプロテイナーゼKの濃度の変化をテストする必要があります。我々はその倍を見つけたりリゾチームおよびプロテイナーゼKの量を三倍にするとLNAフロー- FISHの結果に大きな変化をもたらした。さらに、追加の透過化の条件をテストするとき、細胞が凝集、細胞の損失、およびバックグラウンド蛍光比に得られるべき最高のシグナルを分析する必要があります。セルクランピングの程度は、顕微鏡および/またはフローサイトメトリーによって試験することができる。前方対側方散乱ドットプロットと正しい透過法で尾がこのテーリングの影響を最小限にするようにフローサイトメトリーにより、細胞塊が存在しています。このメソッドは、ハイブリダイゼーションステップの間に追加した後、抗ジゴキシゲニン抗体と二次抗体-フルオロフォアのコンジュゲートで検出できるようなジゴキシゲニンなどの他のハプテンで標識された追加のLNAプローブは前述のようにプロトコルに大きな変更を加えることなくまた多重sRNAの検出に適している。現在、我々はこの方法で発生していることを唯一の制限は弱く元から十分な信号を生成することができない点です。押さsRNA種と努力は(セル当たりの絶対コピー数で)検出のしきい値を決定するために進行中です。
全体的に、LNAフロー- FISH法では、プレゼンスとsRNAの種の相対量とその発現が変化する度合いについての洞察を提供するために、ハイスループットの方法で、単一細胞レベルでの細菌sRNAまたはmRNAの発現を測定する機会を提供します。人口インチ
The authors have nothing to disclose.
この作品は、米国海軍研究所のコアファンドを経由して米海軍研究局によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems/Ambion | AM9625 | |
Nuclease-free water | Applied Biosystems/Ambion | AM9932 | (not DEPC treated) |
32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L2879 | |
Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems/Ambion | AM2546 | |
Formamide | Applied Biosystems/Ambion | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems/Ambion | AM9770 | |
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems/Ambion | AM9680 | Aliquot and freeze |
Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies/Invitrogen | 15401-011 | Aliquot and freeze |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |