تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان في الموقع التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة
Summary
وصفت رواية عالية الإنتاجية الأسلوب الذي يتيح اكتشاف والكميات النسبية للRNA الصغيرة والتعبير مرنا من الخلايا البكتيرية واحد باستخدام مسابر مؤمن الحمض النووي وتدفق الخلوي ومضان<em> في الموقع</em> التهجين.
Abstract
مضان التهجين في الموضع (FISH) هي تقنية قوية التي تستخدم لكشف وتوطين محددة تسلسل الحمض النووي في البيئة الخلوية. من أجل زيادة الإنتاجية ، يمكن الجمع بين سمك مع التدفق الخلوي (تدفق FISH) لتمكين الكشف عن تسلسل الحمض النووي المستهدف في الآلاف من الخلايا الفردية. نتيجة لذلك ، تدفق الأسماك يوفر ميزة واضحة على مدى lysate / الفرقة القائمة على الكشف عن الحمض النووي الأساليب لأن كل خلية يعامل بوصفه مراقبة مستقلة ، مما يسمح أقوى التحليلات الإحصائية والتباين. وقد دفعت هذه الصفات استخدام أساليب السمكية وتدفق الأسماك في عدد من التطبيقات المختلفة ، وكانت فائدة هذه الأساليب أثبتت بنجاح في تحديد هوية طول التيلومير ، 1،2 الخلوية والتعبير الجيني 3،4 ، ورصد تكاثر الفيروس في الخلايا المصابة 5 ، والبكتيرية تحليل المجتمع والتعداد6.
تقليديا ، وقد تم الكشف عنها من خصوصية وسائل السمكية وتدفق الأسماك بواسطة المجسات قليل النوكليوتيد الحمض النووي. لكن في الآونة الأخيرة ، ازداد استبدال تحقيقات مع قليل النوكليوتيد النظير DNA الحمض النووي وتحقيقات السمكية وتدفق الأسماك كلا من حساسية وخصوصية كل تقنية نظرا لارتفاع درجات الحرارة في ذوبان (T م) من هذه الأحماض النووية لالنظير الطبيعي 7،8 . الحمض النووي مؤمن (LNA) تحقيقات هي نوع من التناظرية التي تحتوي على الحمض النووي النيوكليوتيدات LNA ارتفعت طوال تسلسل الحمض النووي الريبي أو 9،10. عندما يقترن مع تدفق الأسماك ، تحقيقات LNA سبق أظهرت التحقيقات أن يتفوق الحمض النووي التقليدية 7،11 واستخدمت بنجاح لكشف حقيقية النواة مرنا 12 و RNA فيروسي في الخلايا الثديية 5.
هنا نوسع هذه القدرة ، ووصف تدفق الأسماك LNA الأسلوب الذي يسمح للكشف محددة من الحمض النووي الريبي في الخلية البكتيريةق (الشكل 1). على وجه التحديد ، ونحن مهتمون في الكشف الصغيرة غير الترميز التنظيمية الحمض النووي الريبي (الحمض الريبي النووي الذواب) والتي استقطبت اهتماما كبيرا في السنوات القليلة الماضية حيث تم العثور عليها لتكون بمثابة العناصر التنظيمية الرئيسية في العديد من العمليات الخلوية الحرجة 13. ومع ذلك ، هناك أدوات محدودة لدراسة sRNAs والتحديات للكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب في الخلايا البكتيرية ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الصغير نسبيا (عادة 5-30 النيوكليوتيدات في الطول) وفرة منخفضة من جزيئات الحمض الريبي النووي الذواب فضلا عن صعوبة في العمل العام مع أصغر الخلايا البيولوجية بدرجات الأغشية الخلوية. في هذه الطريقة ، ونحن تصف التثبيت وpermeabilzation الشروط التي تحافظ على بنية الخلايا البكتيرية والسماح للتغلغل تحقيقات LNA فضلا عن الخطوات التي تمكن من تضخيم إشارة الكشف محددة من الحمض الريبي النووي الذواب فرة منخفضة (الشكل 2).
Protocol
Discussion
وقد استخدم تدفق الأسماك LNA الأسلوب المعروضة هنا للكشف عن التعبير عن الحمض الريبي النووي الذواب من سلبية الغرام البحرية بكتيريا الضمة campbellii التعبير الذي سبق أن أكد عبر التنميط القائم على التعبير ميكروأري وعكس رد فعل البلمرة النسخ 16. حتى الآن ، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لمراقبة التعبير عن مجموعة متنوعة من RNAs (مثلا عبر الحمض الريبي النووي الذواب المشفرة ، التي تعدل الحمض الريبي النووي الذواب نشاط البروتين ، riboswitches ، ومرنا). على هذا النحو ، ونحن واثقون من أن هذه الطريقة قابلة للتكيف ، ويمكن استخدامها للكشف عن أي هدف أو الحمض الريبي النووي الذواب مرنا ويمكن تعديلها لاستخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية أو نوع من الخلايا. إذا كان تعديل هذا البروتوكول هو ضروري لأنواع الخلايا الأخرى ، والمتغير الأهم للنظر في التلاعب هو الخطوة permeabilization. على سبيل المثال ، عند تعديل شروط permeabilization الموصوفة هنا ، يجب اختبار التغيرات في تركيزات بروتين الليزوزيم وكاف. وجدنا أن تضاعف أوثلاثة أضعاف كمية بروتين الليزوزيم وكاف أدى إلى تغييرات كبيرة في النتائج تدفق الأسماك LNA. علاوة على ذلك ، عند اختبار الظروف permeabilization إضافية ، ينبغي تحليل الخلايا للتكتل ، وفقدان الخلية ، ويمكن الحصول على أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية مضان. ويمكن اختبار مدى التثاقل عن الخلية و / أو المجهري التدفق الخلوي. من جانب التدفق الخلوي ، كتل الخلايا موجودة في ذيول في الأمام مقابل الجانب مؤامرة نقطة مبعثر والأسلوب الصحيح permeabilization سيقلل هذا التأثير المخلفات. هذا الأسلوب هو أيضا قابل للكشف عن الحمض الريبي النووي الذواب متعددة دون تعديلات رئيسية في البروتوكول كما هو موضح إضافية يمكن أن تضاف تحقيقات LNA المسمى مع haptens أخرى مثل digoxigenin خلال الخطوة التهجين والكشف عن الأجسام المضادة ثم مع مكافحة digoxigenin والثانوية للأجسام المضادة المتقارن fluorophore. حاليا ، والقيد الوحيد التي واجهناها مع هذا الأسلوب هو عدم قدرتها على توليد ما يكفي من الإشارات السابقة ضعيفةالحمض الريبي النووي الذواب أنواع الضغط والجهود جارية لتحديد عتبة الكشف (في عدد النسخ المطلق لكل خلية).
عموما ، فإن تدفق الأسماك LNA الأسلوب يتيح الفرصة لقياس الحمض الريبي النووي الذواب البكتيرية أو التعبير مرنا على مستوى خلية واحدة بطريقة إنتاجية عالية لتقديم رؤى حول وجود وفرة نسبية لأنواع سرنا والدرجة التي يختلف التعبير عنها في عدد السكان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مكتب البحوث البحرية عبر بحوث البحرية الامريكية الأموال الأساسية مختبر.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems/Ambion | AM9625 | |
| Nuclease-free water | Applied Biosystems/Ambion | AM9932 | (not DEPC treated) |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
| Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L2879 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems/Ambion | AM2546 | |
| Formamide | Applied Biosystems/Ambion | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
| Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
| Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
| Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems/Ambion | AM9770 | |
| Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems/Ambion | AM9680 | Aliquot and freeze |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies/Invitrogen | 15401-011 | Aliquot and freeze |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| 5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
| DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
| Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |
References
- Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
- Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
- Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
- Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
- Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
- Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
- Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
- Obika, S. Synthesis of 2′-O, 4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3′-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
- Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
- Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
- Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
- Waters, L., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136, 615-628 (2009).
- Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
- Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
- Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).
