Een nieuwe high-throughput methode is beschreven die het mogelijk maakt de detectie en de relatieve kwantificatie van kleine RNA en mRNA expressie van enkele bacteriële cellen met behulp van gesloten nucleïnezuur probes en flowcytometrie-fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie.
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een krachtige techniek die wordt gebruikt voor het detecteren en lokaliseren van specifieke nucleïnezuursequenties in de cellulaire omgeving. Met het oog op de doorvoer te verhogen, kan FISH worden gecombineerd met flowcytometrie (flow-FISH) voor de detectie van gerichte nucleïnezuursequenties in duizenden individuele cellen mogelijk te maken. Als gevolg hiervan, flow-FISH biedt een duidelijk voordeel ten opzichte lysaat / ensemble op basis van nucleïnezuur detectiemethoden, omdat elke cel wordt behandeld als een onafhankelijke waarneming, waardoor het toelaat sterker statistische en variantie analyses. Deze attributen hebben geleid tot het gebruik van FISH en flow-FISH methoden in een aantal verschillende toepassingen en het nut van deze methoden is succesvol aangetoond in de lengte van telomeren bepaling 1,2, cellulaire identificatie en genexpressie 3,4, monitoring virale vermenigvuldiging in geïnfecteerde cellen 5, en de bacteriële gemeenschap analyse en inventarisatie6.
Traditioneel is de specificiteit van FISH en flow-FISH methoden zijn bijgebracht door DNA-oligonucleotide probes. Onlangs echter, is de vervanging van DNA-oligonucleotide-probes met nucleïnezuur analogen als FISH en flow-FISH probes verhoogde zowel de sensitiviteit en specificiteit van elke techniek te wijten aan de hogere smelttemperatuur (T m) van deze analogen voor natuurlijke nucleïnezuren 7,8 . Gesloten nucleïnezuur (LNA) probes zijn een soort van nucleïnezuur dat analoge LNA nucleotiden verrijkt door een DNA-of RNA-sequentie 9,10 bevatten. In combinatie met flow-FISH, hebben LNA sondes eerder is aangetoond dat de conventionele DNA-probes 7,11 beter te presteren en zijn met succes gebruikt om de eukaryote mRNA 12 en virale RNA te detecteren in zoogdiercellen 5.
Hier hebben we deze mogelijkheid uit te breiden en beschrijven een LNA flow-FISH methode die de specifieke detectie van RNA-vergunningen in bacteriële cels (figuur 1). In het bijzonder zijn wij geïnteresseerd in de detectie van kleine niet-coderende RNA-regelgeving (Srna), die hebben vergaard grote belangstelling in de afgelopen jaren zoals ze zijn gevonden om te dienen als de belangrijkste elementen van de regelgeving in veel kritische cellulaire processen 13. Er zijn echter beperkt tools om sRNAs en de uitdagingen voor het opsporen van Srna in bacteriële cellen te bestuderen is deels te wijten aan de relatief kleine omvang (meestal 50 tot 300 nucleotiden in lengte) en een lage overvloed van Srna moleculen, evenals de algemene moeilijkheid in het werken met kleinere biologische cellen met verschillende cellulaire membranen. In deze methode, beschrijven we fixatie en permeabilzation voorwaarden die de structuur van de bacteriële cellen te behouden en toestaan dat de penetratie van LNA sondes en signaalversterking stappen die de specifieke detectie van lage abundantie Srna (figuur 2) in te schakelen.
Het LNA flow-FISH methode hier gepresenteerde werd gebruikt om de uitdrukking van een Srna detecteren van de Gram-negatieve mariene bacterie Vibrio Campbellii waarvan de expressie is eerder bevestigd via microarray-based expressie profilering en reverse transcriptie polymerase chain reaction 16. Tot op heden hebben we gebruik gemaakt van deze methode om de expressie van een groot aantal RNA's (bijvoorbeeld trans-gecodeerde Srna, Srna dat de proteïne activiteit, riboswitches, en mRNA moduleren) monitor. Als zodanig, we zijn ervan overtuigd dat de methode flexibel is en kan worden gebruikt om een Srna of mRNA doel te detecteren en kan worden aangepast voor gebruik in alle bacteriesoorten of celtype. Indien wijziging van dit protocol is nodig voor andere celtypes, de belangrijkste variabele om te overwegen manipuleren is de permeabilisatie stap. Bijvoorbeeld, wanneer het wijzigen van de permeabilisatie voorwaarden hier beschreven, moeten wijzigingen in de concentraties van lysozym en proteinase K worden getest. Wij vonden dat een verdubbeling ofverdrievoudiging van de hoeveelheid lysozym en proteinase K heeft geleid tot grote veranderingen in de LNA flow-FISH resultaten. Bovendien, bij het testen van extra permeabilisatie voorwaarden, moeten de cellen worden geanalyseerd voor klonteren, cel verlies, en de beste verkrijgbare signaal op de achtergrond fluorescentie ratio. De mate van cel klonteren kan worden getest door microscopie en / of flowcytometrie. Door middel van flowcytometrie, cel klonten aanwezig zijn als staarten in een voorwaartse vs zijwaartse verstrooiing dot plot en de juiste permeabilisatie methode zal dit tailing effect te minimaliseren. Deze methode is ook vatbaar voor multiplex detectie Srna zonder grote aanpassingen aan de beschreven protocol als extra LNA probes gelabeld met andere haptenen zoals digoxigenine kunnen worden toegevoegd tijdens de hybridisatie stap en vervolgens gedetecteerd met een anti-digoxigenine antilichaam en secundair antilichaam-fluorofoor conjugaat. Momenteel is de enige beperking die we hebben ondervonden met deze methode is het onvermogen om voldoende signaal van zwak ex generereningedrukt Srna soorten en er wordt gewerkt aan de detectiegrens bepalen (in absolute aantal kopieën per cel).
Over het geheel genomen de LNA flow-FISH-methode biedt de mogelijkheid om bacteriële Srna of mRNA expressie te meten op de enkele cel-niveau in een high throughput manier om inzichten over de aanwezigheid en relatieve rijkdom van een Srna soort en de mate waarin de expressie ervan varieert bieden in een populatie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory kern fondsen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems/Ambion | AM9625 | |
Nuclease-free water | Applied Biosystems/Ambion | AM9932 | (not DEPC treated) |
32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L2879 | |
Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems/Ambion | AM2546 | |
Formamide | Applied Biosystems/Ambion | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems/Ambion | AM9770 | |
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems/Ambion | AM9680 | Aliquot and freeze |
Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies/Invitrogen | 15401-011 | Aliquot and freeze |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |