10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

1. Toplam RNA ayırma Hücre / doku 1ml Trizol ekleyin ve 18-22 gazlı bez gerekirse iğne ile homojenize. 200 ul kloroform ve 4 ° C 30 dakika 14.000 rpm dönüş ekle Üst sulu tabaka, 0.5 ul doğrusal akrilamid ekleyin, daha sonra 500 ul izopropanol ekleyin. 20 dakika oda sıcaklığında bekletin. 14.000% 70 etanol ile 4 ° C, yıkama pelet rpm ve vakumlu kuru Spin. 1 ul nükleaz ücretsiz su ve 200 ul PCR tüp transfer süspanse edin. 2. Çift iplikli cDNA hazırlayın Yukarıdaki 1 ul RNA oligo-dT-T7 ters transkripsiyon astar (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 ') 100 mcM 1 ul ısı 70 ° C (ısı blok) 5 dakika, ve buz üzerinde serin ek bileşenini için. 1 ul 5x FS tampon, 0.5 ul DTT, 0.5 ul dNTP karışımı ve 0.5 ul RnaseOUT (Üst Simge II kiti) ekleyin. 42 Isı° C PCR makinesi, 1 dakika sonra 0.5 ul Üstsimge II revers transkriptaz ekleyin. 1 saat inkübe 42 ° C Isı 70 ° C, 10 dakika soğumasını 4 ° C Buz, yukarıdaki reaksiyon için aşağıdaki ekleyin: Nükleazlar serbest su – 22.75 ul 5X İkinci iplikçik tampon – 7.5 ul dNTP mix – 0.75 ul E. coli DNA ligaz – 0.25 ul E. coli DNA polimeraz – 1 ul RnaseH – 0.25 ul 16 2 saat inkübe ° C 1 ul T4 DNA Polimeraz sonra ve 16 ek 10 dakika inkübe ° C 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın ve 80 ul su ekleyin. Doğrusal akrilamid 0.5 ul ekleyin. 72 ul 3 M NH4OAc ve soğuk% 100 etanol 480 ul. -20 ° C'de 1 saat için Çökelme Spin 14,000 rpm'de 4 ° C, 2, 30 dakika 14.000 rpm hızında, 1 ml% 70 etanol ile santrifüj yıkayınYaklaşık 10 dakika boyunca kuru dakika ve vakum. 3. In vitro transkripsiyon poli-A mRNA Amplify 3.5 ul nükleaz ücretsiz su yukarıda cDNA tekrar Yukarıda, 1 ul dNTP (toplam 4 ul), 10X reaksiyon tamponu 1 ul ve T7 polimeraz 1 ul ve Megascript kiti RnaseOUT 0.5 ul ekleyin. 37 inkübe ° C PCR makine gecede. Bir sonraki adım için hazır. -80 Saklanan olabilir ° C 4. Amplifiye poli-A mRNA parçalanması Yukarıdaki reaksiyon ve 4 ul 10x parçalanma reaktif 26 ul su ekleyin. PCR makinede 70 ° C 'de tam 7 dakika için ısıtın. 5 parçalanma stop tampon ul örnek, buz koyun. 5. RNA kadar temiz Yukarıdaki reaksiyon için 60 ul su ve 350 ul Rneasy MinElute kiti tampon RLT ve pipetleme karışım ekleyin. Spin kolon 250 ul etanol, pipetleme karışım ve pipet ekleyin. 20 saniye boyunca 8000 RCF Spin. RPE, 20 saniye boyunca spin ile bir kez yıkayın,% 80 EtOH, 2 dakika boyunca spin ve 5 dakika spin kuru sütun ile ikinci kez yıkayın. 10 ul nükleaz ücretsiz su Zehir RNA. 6. cDNA sentezi Tek okunan kütüphane için ilk iplikçik sentezi: PCR tüp, aşağıdakileri ekleyin: Parçalanmış Poly-A mRNA – 10 ul Noti Rastgele nonamer Astar – 1 ul PCR içinde 5 dakika buz üzerinde hızlı chill 70 ° C'de inkübe edin. Noti Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 '). Rasgele bölgeye kadar sonraki sıra Chip-Seq kiti Illumina adaptörü Yatak sırası ters tamamlayıcısı ise 5 'proksimal sıra Noti kısıtlama sitesinde. <ol= "2" start> Yukarıda, buz üzerinde aşağıdaki (III kiti Üst Simge) ekleyin: 5X ilk iplikçik tampon -4 ul DTT – 2 ul dNTP karışımı * – 1,5 ul 42 az 2 dakika boyunca PCR koyun ° C, 1 ul Üst Simge III ters transkriptaz ekleyin ve 1hr için 42 ° C'de inkübe edin. * Bunun yerine dCTP, 5-metil dCTP dNTP karışımı kullanıldı. Eşleştirilmiş sonunda kütüphane için ilk iplikçik sentezi: PCR tüp, aşağıdakileri ekleyin: Parçalanmış Poly-A mRNA – 10 ul Rastgele hexamer astar – 1 ul PCR içinde 5 dakika buz üzerinde hızlı chill 65 ° C'de inkübe edin. Yukarıda, buz üzerinde aşağıdaki (Üst Simge firststrand III kiti) ekleyin: 5X ilk iplikçik tampon – 4 ul DTT – 2 ul dNTP (dışarıyakiti) – 1.5 ul 45 1 dakika için PCR koyun ° C, Üst Simge III ters transkriptaz 1 ul ekleyin ve 1 saat boyunca 45 ° C'de inkübe. İkinci iplikçik sentezi (iki kütüphaneler için): Yukarıda, buz üzerinde aşağıdaki (Üst Simge II kiti) ekleyin: Su (RNaz ücretsiz) – 91 ul 5X İkinci Strand Tampon – 30 ul dNTP (kit) – 3 ul E. coli DNA ligaz – 1 ul E. coli DNA polimeraz – 4 ul E. coli RNaz H – 1 ul Tersine çevirerek karıştırın tüp, 2 saat için 16 yaşında kısa bir spin ve inkübe ° C vermek. 7. CDNA arındırın Eşleştirilmiş sonunda kütüphane için tek bir okuma ve su 30 ul su 40 ul Zehir Zymo sütunlar, cDNA örnek arındırın. 8. Sona onarım Tek okuma kütüphanesi için: <p class = "jove_content"> (Illumina Chip-Seq örnek hazırlık kiti kullanın) CDNA, yukarıdaki 40 ul ekleyin: 10mM ATP T4 DNA ligaz tamponu – 5 ul dNTP mix – 2 ul T4 DNA polimeraz – 1 ul Klenow enzim (1U / ml su ile 1:05 seyreltilmiş) – 1 ul T4 PNK – 1 ul 20, 30 dakika boyunca termal cycler inkübe ° C Eşleştirilmiş sonuna kütüphanesi için: (Eşleştirilmiş Illumina sonunda numune hazırlık kiti kullanın) Yukarıdaki 30 ul cDNA ekleyin: RNaz DNaz serbest su – 45 ul 10mM ATP T4 DNA ligaz tampon – 10 ul 10mM dNTP karışımı – 4 ul T4 DNA polimeraz – 5 ul Klenow enzim – 1 ul T4 PNK – 5 ul 20, 30 dakika boyunca termal cycler inkübe ° C 9 – cDNA temizleme C cDNA kullanarak Zymo sütun kadar yalın. Eşleştirilmiş sonunda kütüphane için tek bir okuma ve EB 32 ul EB 34 ul Zehir. 10. DNA parçalarının 3 'sonuna kadar' A 'üsleri ekle Tek okuma kütüphanesi için: Aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: DNA – 34 ul Klenow tampon – 5 ul dATP – 10 ul Klenow exo – 1 ul 37 az 30 dakika boyunca inkübe ° C Eşleştirilmiş sonuna kütüphanesi için: Aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: DNA – 32 ul Klenow tampon – 5 ul dATP – 10 ul Klenow exo – 3 ul 37 az 30 dakika boyunca inkübe ° C 11. cDNA temizleme CDNA zymo sütunlarını kullanarak temizleyin. EB 10 ul elute. 12. Adaptör ligasyonu jove_step "> tek okumak kütüphane için: (Illumina Chip-Seq örnek hazırlık kiti kullanın) Aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: DNA – 10 ul Adaptör Oligo Mix – 1 ul 2X DNA ligaz Tampon -15 ul DNA ligaz – 4 ul Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Adaptörler buz ve sulandırılmış 01:20 çözdürülmelidir. Eşleştirilmiş sonuna kütüphanesi için: (Eşleştirilmiş Illumina sonunda numune hazırlık kiti kullanın) Aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: DNA – 10 ul PE Adaptör Oligo Mix – 10 ul 2X DNA ligaz Tampon – 25 ul DNA ligaz – 5 ul 15 dakika boyunca inkübe 20 ° C Adaptörler buz ve sulandırılmış 01:20 çözdürülmelidir. 13. Ligasyon reaksiyonu kadar temiz Ligasyon reaksiyonu zy kullanarak temizleyinmo sütun. EB 5 ul eşleştirilmiş sonunda kütüphane için başka bir elüsyon takip tek okuma kütüphane ve EB 6 ul su 44 ul Zehir. Noti sindirim gerçekleştirin, SADECE tek okuma kitaplığı için cDNA – 44 ul NEB tampon 3 – 5 ul BSA – 0.5 ul Noti – 1 ul 37 ° C ve zymo sütunu kullanarak arındırır tepki gecede 2 saat süreyle inkübe edin. 6 tampon EB ul Zehir 5 ul EB ile ikinci bir elüsyon izledi. 14. Boyutu seçimi / Jel arıtma Invitrogen% 2 SYBR Güvenli E-Jel kullanarak aşağıdaki gerçekleştirin. Programı 0-PreRun 2 dakika çalıştırın. Invitrogen seyreltilmiş 01:04 1KB artı merdiven yerleştirin ve 10 ul yük. DNA örneği yükleyin ve su 10 ul ile boş şerit doldurun. 1-Programı çalıştırın Egel% 2 28 dakika çalıştırın. Büyüklüğü 200-300 bp jel dilim seçine yeni bir jilet ile. 15. Zehir DNA jel dilim Jel dilim tartılır ve 1 hacim jel (Qiagen kullanmak Jel Ekstraksiyon kiti) QG tampon 3 cilt ekleyin 50 ° C'de 10 dakika veya jel dilim eriyene kadar. 1 ispropanol hacmi ve inversiyon veya pipetleme karışımı ekleyin. 1 dakika maksimum hızda sütun, spin ekleyin ve flow-through atın. Sütun QG Tampon 500 ul, 1 dakika boyunca maksimum hızda spin ekleyin ve akışı ile atın. Tampon PE 750 ul sütun ekleyin, 1 dakika maksimum hızda spin ve akış atın. 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Eşleştirilmiş sonunda kütüphane için tek bir okuma ve 23 ul EB EB 36 ul Zehir. 16. PCR Tek okuma kütüphanesi için: (Illumina Chip-Seq örnek hazırlık kiti kullanın) Izlemeye hazırlanıng PCR reaksiyon karışımı: DNA – 36 ul 5X Phusion tampon – 10 ul dNTP mix – 1.5 ul PCR primer 1,1 – 1 ul PCR primer 2,1 – 1 ul Phusion polimeraz – 0.5 ul Aşağıdaki PCR protokolü kullanın: 30 saniye 98 ° C 10 döngü: 10 saniye 98 ° C 30 saniye 65 ° C 72 ° C'de 30 saniye 5 dakika 72 ° C 4 tutun ° C * Kiti kullanılmaktadır ilk kez, EB tamponu ile PCR primerleri 01:02 sulandırmak. Eşleştirilmiş sonuna kütüphanesi için: (Eşleştirilmiş Illumina sonunda numune hazırlık kiti kullanın) Aşağıdaki PCR reaksiyonu hazırlayın: DNA – 23 ul Phusion DNA polimeraz – 25 ul PCR primer PE 1,1 – 1 ul PCR primer PE 2.1 -1 ul Aşağıdaki PCR protokolü kullanarak Amplify: 30 saniye 98 ° C 10 döngü: 10 saniye 98 ° C 30 saniye 65 ° C 72 ° C'de 30 saniye 5 dakika 72 ° C 4 tutun ° C * Kiti kullanılmaktadır ilk kez, EB tamponu ile PCR primerleri 01:02 sulandırmak. 17. Kütüphane kadar temiz Zymo sütunlarını kullanarak kütüphane temizleyin. EB 12 ul içinde Zehir 18. Asitli kütüphane Asitli kütüphane Qubit kullanarak. Bu sıralama için hazırdır. Tek okuma kütüphane ve eşleştirilmiş son kitaplığı için V4 veya daha yüksek Illumina eşleştirilmiş sonunda küme nesil kiti V4 veya daha yüksek Illumina tek okuma küme nesil kiti sıralama astarları kullanın. 19. Veri analizi Papyon 6 map RefSeq gen seti (NCBI Yapı 36.1) okur. Tek sona okur (30 nükleotidler) ve çift gen seti 10 maçı sağlayan ve okuma başına iki uyumsuzlukları için izin sonunda eşlenmiş (42 nükleotidler) okur. Başına Milyon (TPM) değerleri Transkriptler RSEM 7 (Beklenti maksimizasyonu ile RNA-Seq) kullanılarak gen ekspresyonu ölçmek için elde edilmiştir. 20. Temsilcisi Sonuçlar: Biz, her ikisi de tek okuma ve eşli sonunda toplam RNA (Şekil 1) başlayarak 1 mg, 100 mg, 10 mg, 1 mg ve 100 pg çalışan T7LA kütüphaneler yaptı . Bizim protokol değerlendirilmesi için, biz, tek asgari amplifikasyon var, "MinAmp" olarak adlandırılan 10 mg total RNA Bu kontrol kütüphaneler, başlangıç ​​T7 RNA amplifikasyon olmadan sonuna kütüphaneler okudum ve eşleştirilmiş. Tabi sadece amplifikasyon Illumina sıralama adaptörleri, tüm kütüphaneler için ortak bir adım Arter PCR protokol sonuna yakın 10 döngüleri vardır. Tüm RNA kullanılan H14 izole edildiinsan embriyonik kök hücreleri 8. Önce çeşitli kütüphaneleri (Tablo 1 ve Ek Tablo 1) tarafından tespit edilen genlerin sayısı değerlendirildi. 10 ng T7LA kütüphaneler, her ikisi de tek bir okuma ve eşli sonuna kitaplıkları için 10 veya daha fazla bir TPM ile 10 mikrogram MinAmp kütüphaneler gibi hemen hemen aynı sayıda gen belirledi. Tek okuma kütüphanelerin durumda, 10 ng T7LA kütüphane, 10 mikrogram Yükseltilmemiş kütüphane tarafından belirlenen 8500 genlerin% 100 belirledi. 10 ng T7LA kütüphane eşleştirilmiş son kitaplıkları için, 10 mg Yükseltilmemiş kitaplığı (9267 genlerin 7961) tarafından tespit edilen genlerin% 86 belirledi. Az 10 ng yapılan Kütüphaneler birçok genler olarak tespit etmek mümkün değildi. Örneğin, tek okuma protokolü, 1 ng kütüphane sadece tespit ~ 10 mg MinAmp kütüphane tarafından belirlenen genlerin% 50, bize T7LA protokolü 10 ng ile kullanmak için en düşük toplam RNA miktarını sınırlamak isteyen. Ayrıca, housekeeping gen haritalama, GAPDH (Şekil 2), en azından başlangıç ​​RNA 10ng ile yapılan bütün T7LA kütüphaneler aşırı 5 'ekson dahil olmak üzere, tüm ekzon tespit olduğunu gösterir. MinAmp kütüphaneleri ile 10 ng T7LA tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler Karşılaştırılması, yüksek bir benzerlik derecesi (sırasıyla Spearman korelasyon katsayısı, R = 0.90 ve 0.95, Şekil 3a ve b) gösterir. Ayrıca 10 ng toplam RNA yapılan iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler karşılaştırılmış ve her iki kütüphane türleri (çok benzer bir gen ekspresyonu imza üretmek T7LA protokolü kullanılarak yapılan gösteren, çok yüksek bir korelasyon katsayısı (R = 0.92) vardı Şekil 3c). Bu nedenle, T7LA yöntemi, güvenilir ve MinAmp kütüphaneler gibi kapsamlı bir sıralama kütüphaneler üretmek mümkün, ancak ila 1000 kat daha az başlangıç ​​materyali. Şekil 1 eşleştirilmiş sonuna Şema ve tek okuma kütüphane hazırlık protokolü. jove_content "> Şekil 2 tüm tek okunur ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler için housekeeping gen, GAPDH bir genom tarayıcı resmi. Tek okuma kütüphaneler için soldaki ölçek çubuğu toplam 350 okur gösterir. Eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler için merkezi ölçek çubuğu toplam 5000 okur gösterir. Yatay eksen GAPDH genom dizisi temsil eder. Şekil 3 Korelasyon (Spearman) çeşitli kütüphaneler arasında gen ifadelerinin: A. yılları arasında tek bir okuma 10 ng T7LA ve 10 mikrogram MinAmp kütüphanesi, bu kütüphanelerin de çok benzer bir gen ekspresyonu paterni (R = 0.90) olduğunu göstermektedir B. eşleştirilmiş sonuna arasında 10 ng T7LA ve 10 mikrogram MinAmp kütüphane gen ekspresyon profilleri benzerlik göstermektedir (R = 0.95). gen eski C. Korelasyon10 ng eşleştirilmiş sonu ve 10 ng tek okunan kütüphaneler arasında pressions T7LA yöntemi (R = 0.92) tarafından hazırlanan bu kütüphaneler arasında yüksek derecede bir benzerlik göstermektedir. Şekil 4 Kimlik tüm tek okunur ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler insan embriyonik kök hücre özel genes5. Kütüphane Tipi ° Ham Kümeleri Filtre geçen% Kümeleri % Genomuna hizalama % Hata Oranı Genler tespit MinAmp 10ug Tek okuma 225.602 + / – 4952 65.48 + / – 2.58 47,61 + / – 0.53 0.62 + / – 0.06 8500 1ug T7LA Tek okuma 144.818 + / – 6513 82,21 + / – 6.45 48,09 + / – 0.27 0.42 + / – 0.03 8757 100ng T7LA Tek okuma 27.385 + / – 1818 81.33 + / – 11.75 44.46 + / – 4.53 0.49 + / – 0.10 8709 10ng T7LA Tek okuma 11.184 + / – 985 60.70 + / – 3.70 14.96 + / – 1.15 0.99 + / – 0.30 8589 1ng T7LA Tek okuma 12.695 + / – 1365 53,27 + / – 16.76 4.08 + / – 0.79 2.25 + / – 1.56 4720 100pg T7LA Tek okuma 10390 + / – 1398 72,99 + / – 2.90 1.48 + / – 0.20 1.51 + / – 0.39 1121 MinAmp 10ug Eşleştirilmiş Sona R1 95786 + / – 12.937 90.77 + / – 2.79 58.50 + / – 0.95 0.94 + / – 0.38 9267 Eşleştirilmiş Sona R2 95786 + / – 12.937 90.77 + / – 2.79 58,13 + / – 1.13 0.99 + / – 0.37 1ug T7LA Eşleştirilmiş Sona R1 297.669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 46.89 + / – 0.14 0.47 + / – 0.01 7334 Eşleştirilmiş Sona R2 297.669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 45,52 + / – 0.12 0.51 + / – 0.01 100ng T7LA Eşleştirilmiş Sona R1 205.602 + / – 9932 90,53 + / – 0.76 63,44 + / – 1.00 0.48 + / – 0.02 8011 Eşleştirilmiş Sona R2 205.602 + / – 9932 90,53 + / – 0.76 61.80 + / – 8.09 0,60+ / – 0.36 10ng T7LA Eşleştirilmiş Sona R1 214.622 + / – 11.155 89.98 + / – 1.13 56,32 + / – 1.94 0.80 + / – 0.26 7961 Eşleştirilmiş Sona R2 214.622 + / – 11.155 89.98 + / – 1.13 46.41 + / – 18,39 2.48 + / – 2.68 ; 1ng T7LA Eşleştirilmiş Sona R1 144.951 + / – 19.841 90,54 + / – 1.19 3.91 + / – 0.16 8.71 + / – 0.86 8124 Eşleştirilmiş Sona R2 144.951 + / – 19.841 90,54 + / – 1.19 3.27 + / – 1.21 9.11 + / – 3.52 100pg T7LA Eşleştirilmiş Sona R1 187.600 + / – 11.759 89,52 + / – 1.11 1.78 + / – 0.05 13.42 + / – 0.50 6623 </td> Eşleştirilmiş Sona R2 187.600 + / – 11.759 89,52 + / – 1.11 1.99 + / – 0.23 15.29 + / – 0.96 ° R1 ve R2 ve bir etiket dizileri ters * ≥ 10 TPM Tablo 1. gen küme numaraları, hata oranı, yüzde hizalama tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler. Ek Tablo 1 tüm örnekler için genler ve TPM değerleri listesi, tek okudum ve sonunda eşleştirilmiş.