Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

1. Isolar RNA total Adicionar 1 ml Trizol para as células / tecidos, e homogeneizar com agulha 18-22 gaze se necessário. Adicionar 200 mL de clorofórmio, e girar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C. Retire camada aquosa superior, adicione 0,5 mL de acrilamida linear, em seguida, adicione 500 mL de isopropanol. Deixe descansar em temperatura ambiente por 20 minutos. Giram a 14.000 rpm a 4 ° C, lavar pellet com etanol 70%, e vácuo seco. Ressuspender em 1 mL de água nuclease livre e transferir para tubo de 200 mL PCR. 2. Prepare dupla fita de cDNA Ao acima de 1 RNA mL adicionar 1 ml de 100 M oligo-dT-T7 cartilha transcrição reversa (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), o calor a 70 ° C (bloco de calor) por 5 min, e encaixe legal no gelo. Adicione 1 mL tampão FS 5x, 0,5 mL DTT, 0,5 mL mix dNTP e 0,5 mL RnaseOUT (de SuperScript II kit). Calor a 42° C na máquina de PCR por 1 minuto, em seguida, adicionar 0,5 mL Sobrescrito transcriptase reversa II. Incubar por 1 hora a 42 ° C. Calor a 70 ° C por 10 minutos, arrefecer a 4 ° C. No gelo, adicione o seguinte para a reação acima: Água livre de nuclease – 22,75 mL 5X tampão vertente Segundo – 7,5 mL dNTP mix – 0,75 mL E. coli DNA Ligase – 0,25 mL E. coli DNA polimerase – 1 ml RnaseH – 0,25 mL Incubar por 2 horas a 16 º C, em seguida, adicionar 1 mL T4 DNA polimerase, e incubar por mais 10 minutos a 16 ° C. Transferência para 1,5 tubo eppendorf ml, e adicionar 80 mL de água. Adicionar 0,5 mL de acrilamida linear. Adicionar 72 mL 3 M e 480 mL NH4OAc de etanol a 100% frio. Precipitar para 1 hr a -20 ° C. Giram a 14.000 rpm a 4 ° C por 30 minutos, lave com 1 mL de etanol a 70%, centrifugar a 14.000 rpm por 2minutos, a vácuo e seco por aproximadamente 10 minutos. 3. Amplificar poli-A do mRNA por transcrição in vitro Ressuspender acima cDNA em 3,5 mL de água livre de nuclease. Ao acima, adicionar 1 ml cada um dos dNTPs (4 mL total), 1 ml de tampão de reação 10X e 1 ml de polimerase T7, e 0,5 mL de RnaseOUT de kit Megascript. Incubar a 37 ° C na máquina de PCR durante a noite. Pronto para o próximo passo. Podem ser armazenadas a -80 ° C. 4. Fragmentação do amplificada poli-A do mRNA Adicionar 26 mL de água a reação acima e 4 mL de reagente fragmentação 10x. Calor na máquina de PCR em 70 ° C por exatamente sete minutos. Adicionar 5 mL de tampão parar de fragmentação, coloque amostra no gelo. 5. RNA limpar Para a reação acima, adicionar 60 mL de água e 350 uL de tampão RLT de kit MinElute Rneasy, e misture por pipetagem. Adicionar 250 mL de etanol, a mistura por pipetagem e uma pipeta na coluna spin. Giram a 8000 rcf durante 20 segundos. Lavar uma vez com RPE, spin por 20 segundos, lave segunda vez com EtOH 80%, spin por 2 minutos, e coluna seca com 5 minutos de rotação. Eluir RNA em 10 ml de água livre de nuclease. 6. síntese de cDNA Síntese primeira vertente para a biblioteca ler single: Em um tubo de PCR, adicione o seguinte: Fragmentado Poly-A mRNA – 10 ml NotI Primer nonamer Random – 1 ml Incubar a 70 ° C por 5 minutos em termociclador e frio rápido no gelo. NotI Primer Nonamer (-3 5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN '). A 5 'seqüência proximal é o sítio de restrição NotI enquanto a próxima seqüência até que a região aleatória é o complemento reverso da Illumina B do adaptador seqüência de Chip-Seq kit. <olstart = "2"> Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript III kit): ML tampão 5X primeira vertente -4 TDT – 2 l dNTP mistura * – 1,5 mL Colocar em termociclador por 2 minutos a 42 ° C, adicione 1 ml de SuperScript transcriptase reversa III, e incubar a 42 ° C por 1h. * Em vez de dCTP, 5-metil dCTP foi utilizado na mistura dNTP. Síntese primeira vertente para a biblioteca final emparelhados: Em um tubo de PCR, adicione o seguinte: Fragmentado Poly-A mRNA – 10 ml Cartilha hexâmero aleatória – 1 ml Incubar a 65 ° C por 5 minutos em termociclador e frio rápido no gelo. Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript firststrand III kit): Tampão 5X primeira vertente – 4 mL TDT – 2 l dNTPs (dekit) – 1,5 mL Colocar em termociclador por 1 min a 45 ° C, adicione 1 ml de SuperScript transcriptase reversa III, e incubar a 45 ° C por 1 hora. Síntese segunda vertente (para ambas as bibliotecas): Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript kit II): Água (RNase free) – 91 mL Tampão 5X Segundo Strand – 30 mL dNTPs (de kit) – 3 mL E. coli DNA Ligase – 1 ml E. coli DNA polimerase – 4 mL E. coli RNase H – 1 ml Misture por inversão do tubo, dá um giro de curto e incubar a 16 ° C por 2 horas. 7. Purify cDNA Purify amostra cDNA com colunas Zymo, eluir em 40 mL de água para leitura individuais e 30 l de água para a biblioteca final emparelhados. 8. Reparo final Para a biblioteca ler single: <p class = "jove_content"> (Use Illumina Chip-Seq amostra prep kit) Para a 40 mL acima de cDNA, acrescentar: Tampão ligase T4 DNA com 10mM ATP – 5 mL dNTP mix – 2 l DNA polimerase T4 – 1 ml Klenow enzima (diluído 1:5 com água para 1U / mL) – 1 ml PNK T4 – 1 ml Incubar no termociclador por 30 minutos a 20 ° C. Para a biblioteca final emparelhados: (Use Illumina emparelhado final amostra kit prep) À 30 mL acima cDNA, acrescentar: RNase água DNase livre – 45 mL Tampão ligase T4 DNA com 10mM ATP – 10 ml 10mM mix dNTP – 4 mL DNA polimerase T4 – 5 mL Klenow enzima – 1 ml PNK T4 – 5 mL Incubar no termociclador por 30 minutos a 20 ° C. 9. limpeza cDNA C lean up cDNA colunas usando Zymo. Eluir em 34 mL de EB para leitura individuais e 32 mL de EB para a biblioteca final emparelhados. 10. Adicionar 'A' bases para acabar com a 3 'dos ​​fragmentos de DNA Para a biblioteca ler single: Prepare a mistura de reacção seguinte: Amostra de DNA – 34 mL Klenow buffer – 5 mL dATP – 10 ml Klenow exo – 1 ml Incubar por 30 minutos a 37 ° C. Para a biblioteca final emparelhados: Prepare a mistura de reacção seguinte: Amostra de DNA – 32 mL Klenow buffer – 5 mL dATP – 10 ml Klenow exo – 3 mL Incubar por 30 minutos a 37 ° C. 11. limpeza cDNA Limpar cDNA colunas zymo usando. Eluir em 10 ml de EB. 12. Ligadura adaptador jove_step "> Para ler única biblioteca: (Use Illumina Chip-Seq amostra prep kit) Prepare a mistura de reacção seguinte: Amostra de DNA – 10 ml Adaptador Oligo Mix – 1 ml 2X DNA Ligase mL-Buffer -15 DNA ligase – 4 mL Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Adaptadores devem ser descongeladas em gelo e 01:20 diluída. Para a biblioteca final emparelhados: (Use Illumina emparelhado final amostra kit prep) Prepare a mistura de reacção seguinte: Amostra de DNA – 10 ml PE Adapter Mix Oligo – 10 ml 2X tampão de DNA Ligase – 25 mL DNA ligase – 5 mL Incubar por 15 minutos a 20 ° C. Adaptadores devem ser descongeladas em gelo e 01:20 diluída. 13. Reação ligadura limpar Limpar a reação utilizando ligadura zycolunas mo. Eluir em 44 mL de água para a biblioteca ler único e 6 mL de EB seguido por outro de eluição em 5 mL de EB para a biblioteca final emparelhados. Realizar uma digestão NotI, SOMENTE para a biblioteca ler única cDNA – 44 mL NEB tampão 3-5 mL BSA – 0,5 mL NotI – 1 ml Incubar por 2 horas durante a noite a 37 ° C, ea reação purificar utilizando coluna zymo. Eluir com 6 mL de tampão EB seguido por um segundo eluição com 5 mL de EB. 14. Purificação tamanho da seleção / Gel Execute o seguinte usando a 2% Sybr Seguro E-Gel da Invitrogen. Executar Programa 0-PreRun 2 minutos. Carga 1kb plus escada da Invitrogen 01:04 diluída, e carregar 10 ml. Carregar todos amostra de DNA, e encher pistas vazio com 10 ml de água. Executar Programa 1-Egel 2% Run 28 minutos. Selecione o tamanho 200-300 bp gel slice com uma lâmina de barbear fresco. 15. Eluir o DNA de fatia gel Pesar fatia gel, e adicionar 3 volumes de tampão QG para 1 volume de gel (use kit Extraction Gel de Qiagen) Incubar a 50 ° C por 10 minutos ou até que fatia gel se dissolve. Adicionar um volume de ispropanol, e misturar por inversão ou pipetagem. Adicionar a girar coluna, por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar por escoamento. Adicionar 500 mL de tampão QG para a coluna, spin por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar fluir. Adicionar 750 mL de tampão PE à coluna, spin por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar fluir. Centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima. Eluir em 36 mL de EB para leitura individuais e 23 mL para a biblioteca EB final emparelhados. 16. PCR Para a biblioteca ler single: (Use Illumina Chip-Seq amostra prep kit) Prepare o following mistura de reacção da PCR: DNA – 36 mL Phusion tampão 5X – 10 ml dNTP mix – 1,5 mL PCR primário 1,1-1 mL PCR primário 2,1-1 mL Polimerase Phusion – 0,5 mL Use o seguinte protocolo de PCR: 30 segundos a 98 ° C 10 ciclos de: 10 segundos a 98 ° C 30 segundos a 65 ° C 30 segundos a 72 ° C 5 minutos a 72 ° C Segure a 4 ° C * A primeira vez que o kit é usado, diluir PCR primers 1:2 com tampão EB. Para a biblioteca final emparelhados: (Use Illumina emparelhado final amostra kit prep) Prepare a reação de PCR seguinte: DNA – 23 mL Polimerase DNA Phusion – 25 mL PCR primário PE 1,1-1 mL PCR primário PE 2.1 -1 ml Amplificar usando o seguinte protocolo de PCR: 30 segundos a 98 ° C 10 ciclos de: 10 segundos a 98 ° C 30 segundos a 65 ° C 30 segundos a 72 ° C 5 minutos a 72 ° C Segure a 4 ° C * A primeira vez que o kit é usado, diluir PCR primers 1:2 com tampão EB. 17. Biblioteca de limpar Limpar biblioteca usando colunas zymo. Eluir em 12 mL de EB 18. Quantificar biblioteca Biblioteca quantificar usando Qubit. Ele está pronto para o seqüenciamento. Use primers de seqüenciamento de Illumina kit geração leu único cluster V4 ou superior para biblioteca de leitura simples e Illumina emparelhado final kit geração de clusters V4 ou superior para biblioteca final emparelhados. 19. A análise dos dados Bowtie 6 foi usado para map lê para o conjunto de genes RefSeq (NCBI Construir 36.1). O fim único lê (30 nucleotídeos) e lê o final par (42 nucleotídeos) foram mapeadas, permitindo até 10 partidas para o conjunto de genes, e permitindo até dois desencontros por ler. Transcrições por milhão (TPM) valores foram obtidos para medir a expressão gênica usando RSEM 7 (RNA-Seq por Expectation-Maximization). 20. Resultados representativos: Fizemos T7LA bibliotecas para tanto o fim único de leitura e emparelhado vai de 1 mg, 100 mg, 10 mg, 1 mg e 100 pg começando RNA total (Figura 1). Para avaliação do nosso protocolo, fizemos única leitura e bibliotecas emparelhado fim sem amplificação T7 RNA a partir de 10 mg RNA totais Essas bibliotecas de controle, denominado "MinAmp", têm amplificação mínimo. A amplificação só eles sofrem são os 10 ciclos de PCR perto do final do protocolo para ligadura dos adaptadores Illumina seqüenciamento, um passo comum a todas as bibliotecas. Todos usados ​​RNA foram isoladas de H14células tronco embrionárias humanas 8. Primeiro, avaliamos o número de genes identificados por várias bibliotecas (Tabela 1 e Tabela Complementar 1). Para ambas as bibliotecas único fim ler e emparelhado, a 10 bibliotecas ng T7LA identificados quase o mesmo número de genes como as bibliotecas MinAmp 10 mg, com uma TPM de 10 ou mais. No caso das bibliotecas única leitura, a 10 ng T7LA biblioteca identificados em 100% dos 8.500 genes identificados pela biblioteca mcg 10 sem amplificação. Para bibliotecas final emparelhados, a 10 ng T7LA biblioteca identificou 86% dos genes identificados pela biblioteca mcg 10 sem amplificação (7.961 de 9267 genes). Bibliotecas feita a partir de menos de 10 ng não foram capazes de identificar como muitos genes. Por exemplo, no protocolo de leitura única, a uma biblioteca ng identificado apenas ~ 50% dos genes identificados pela biblioteca MinAmp 10 mg, levando-nos para limitar a menor quantidade de RNA total para uso com o protocolo T7LA a 10 ng. Além disso, o mapeamento de um gene housekeeping, GAPDH (Figura 2) mostra que todas as bibliotecas T7LA feitas com, pelo menos, 10ng de RNA a partir identificados todos os exons, incluindo os 5 extrema "exon. Comparação dos 10 ng T7LA única bibliotecas final ler e emparelhado com as bibliotecas MinAmp mostra um alto grau de similaridade (correlação de Spearman, R = 0,90 e 0,95, respectivamente, Figuras 3a e b). Também comparamos as duas bibliotecas único fim ler e emparelhado feita a partir de 10 ng de RNA total e eles tiveram um coeficiente de correlação muito alta (R = 0,92), demonstrando que ambos os tipos de bibliotecas feitas usando o protocolo T7LA produzir uma assinatura expressão muito semelhante gene ( Figura 3c.). Assim, o método T7LA é capaz de produzir bibliotecas de sequenciamento que são tão confiáveis ​​e abrangentes como as bibliotecas MinAmp, mas a partir de 1000 vezes menos material de partida. Figura 1 Esquema de final par e protocolo de preparação única leitura da biblioteca. jove_content "> Figura 2 Uma imagem browser genoma de um gene housekeeping, GAPDH, para todas as bibliotecas único fim ler e emparelhados. A barra de escala à esquerda para as bibliotecas única leitura indica 350 Total de leituras. A barra de escala no centro para as bibliotecas final emparelhado indica 5000 Total de leituras. O eixo horizontal representa a seqüência do genoma de GAPDH. Figura 3 Correlação de expressões de genes entre as várias bibliotecas (Spearman):. A. Entre única leia 10 ng T7LA e 10 mg biblioteca MinAmp mostra que ambas as bibliotecas têm um padrão de expressão de genes muito semelhantes (R = 0,90) B. Entre o final emparelhado 10 ng T7LA e 10 mg biblioteca MinAmp demonstra sua semelhança de perfis de expressão gênica (R = 0,95). C. Correlação de gene excompressões entre 10 ng final emparelhados e 10 ng única bibliotecas ler mostram um alto grau de semelhança entre estas bibliotecas preparadas pelo método T7LA (R = 0,92). Figura 4 Identificação de genes5 células-tronco embrionárias humanas específicas de todas as bibliotecas único fim ler e emparelhados. Biblioteca Tipo ° Clusters primas Clusters% passando filtro Alinhando% no genoma Taxa de erro% Genes identificados MinAmp 10ug Leitura única 225.602 + / – 4952 65,48 + / – 2,58 47,61 + / – 0,53 0,62 + / – 0,06 8500 1UG T7LA Leitura única 144.818 + / – 6513 82,21 + / – 6,45 48,09 + / – 0,27 0,42 + / – 0,03 8757 100ng T7LA Leitura única 27.385 + / – 1818 81,33 + / – 11,75 44,46 + / – 4,53 0,49 + / – 0,10 8709 10ng T7LA Leitura única 11.184 + / – 985 60,70 + / – 3,70 14,96 + / – 1,15 0,99 + / – 0,30 8589 1ng T7LA Leitura única 12.695 + / – 1365 53,27 + / – 16,76 4,08 + / – 0,79 2,25 + / – 1,56 4720 100PG T7LA Leitura única 10.390 + / – 1398 72,99 + / – 2,90 1,48 + / – 0,20 1,51 + / – 0,39 1121 MinAmp 10ug R1 End emparelhado 95.786 + / – 12937 90,77 + / – 2,79 58,50 + / – 0,95 0,94 + / – 0,38 9267 R2 End emparelhado 95.786 + / – 12937 90,77 + / – 2,79 58,13 + / – 1,13 0,99 + / – 0,37 1UG T7LA R1 End emparelhado 297.669 + / – 10196 91,35 + / – 0,36 46,89 + / – 0,14 0,47 + / – 0,01 7334 R2 End emparelhado 297.669 + / – 10196 91,35 + / – 0,36 45,52 + / – 0,12 0,51 + / – 0,01 100ng T7LA R1 End emparelhado 205.602 + / – 9932 90,53 + / – 0,76 63,44 + / – 1,00 0,48 + / – 0,02 8011 R2 End emparelhado 205.602 + / – 9932 90,53 + / – 0,76 61,80 + / – 8,09 0,60+ / – 0,36 10ng T7LA R1 End emparelhado 214.622 + / – 11155 89,98 + / – 1,13 56,32 + / – 1,94 0,80 + / – 0,26 7961 R2 End emparelhado 214.622 + / – 11155 89,98 + / – 1,13 46,41 + / – 18,39 2,48 + / – 2,68 ; 1ng T7LA R1 End emparelhado 144.951 + / – 19841 90,54 + / – 1,19 3,91 + / – 0,16 8,71 + / – 0,86 8124 R2 End emparelhado 144.951 + / – 19841 90,54 + / – 1,19 3,27 + / – 1,21 9,11 + / – 3,52 100PG T7LA R1 End emparelhado 187.600 + / – 11759 89,52 + / – 1,11 1,78 + / – 0,05 13,42 + / – 0,50 6623 </td> R2 End emparelhado 187.600 + / – 11759 89,52 + / – 1,11 1,99 + / – 0,23 15,29 + / – 0,96 ° R1 e R2 são frente e verso, sequências de uma tag * ≥ 10 TPM Tabela Informações 1. Sobre os números de cluster, genes identificados, a taxa de erro, o alinhamento por cento da única bibliotecas final ler e emparelhados. Tabela Suplementar 1. Lista de todos os genes e seus valores de TPM para todas as amostras, leia única e emparelhado fim.