10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

1。トータルRNAを分離細胞/組織に1ミリリットルトリゾールを追加し、必要に応じて18〜22ガーゼの針でホモジナイズする。 200μlのクロロホルムを追加し、4℃で30分間14,000 rpmでスピン℃、 上部の水層を取り出し、0.5μlのリニアアクリルアミドを追加し、その後500μlのイソプロパノールを加える。室温で20分間放置します。 4℃で14,000 rpmでスピン° C、70％エタノールで洗浄ペレット、および真空乾燥を。 1μlのヌクレアーゼフリー水と200μlのPCRチューブへの転送に再懸濁します。 2。二本鎖cDNAを準備する上記1μlのRNAへのオリゴdT – T7逆転写プライマー（5' – GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3'）100μMを1μl、70℃の熱を加える° C（ヒートブロック）で5分間、氷上でクールなスナップ用。 1μlの5 × FSのバッファー、0.5μlのDTT、0.5μlのdNTPミックスおよび0.5μlのRnaseOUTを（スーパースクリプトIIキットから）を追加します。 42〜ヒート° Cは、PCRのマシンで1分間、その後、0.5μlのスーパースクリプトII逆転写酵素を加える。 42℃1時間インキュベート℃に 70熱℃で10分間、クールに4℃ 氷の上で、上記の反応に以下を追加します。 ヌクレアーゼフリー水 – 22.75μL 5Xセカンドストランドバッファー – 7.5μlの dNTPミックス – 0.75μL 大腸菌DNAリガーゼ – 0.25μL 大腸菌のDNAポリメラーゼ – 1μL RnaseH – 0.25μL ° C、1μlのT4 DNAポリメラーゼを追加し、16でさらに10分間インキュベート16で2時間インキュベート℃に 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに移し、80μlの水を加える。 リニアアクリルアミド0.5μlを添加する。 72μlの3 M NH4OAcと冷100％エタノールを480μlを添加する。 -20℃で1時間沈殿物 4℃、14,000 rpmでスピン℃で30分間、1 mLの70％エタノールで洗浄、2の14,000 rpmで遠心分、そして約10分間乾燥した真空。 3。ポリ- in vitro転写によるmRNAを増幅する 3.5μLのヌクレアーゼフリー水でcDNAを上記の再懸濁します。 上記に、1μlのdNTPの各（合計4μL）、10 ×反応緩衝液1μlとT7ポリメラーゼを1μl、およびMegascriptキットからRnaseOUT 0.5μLを加える。 37℃のPCRマシンのC一晩。 次のステップの準備ができて。 -80℃で保存することができます℃に 4。増幅されたポリ- mRNAの断片化上記の反応と4μlの10倍の断片化試薬に水26μlを添加する。 70℃で正確に7分間のPCRマシンの熱。 断片化の停止緩衝液5μl加え、氷上にサンプルを置く。 5。 RNAのクリーンアップ上記の反応に、60μlの水とRNeasyアプライキットからのBuffer RLT350μlの、ピペッティングにより混合を追加。 スピンカラムに250μlのエタノール、ピペッティングにより混合し、ピペットを追加。 20秒8000 rcfでスピン。 RPE、20秒間スピンで1回洗浄、80％エタノール、2分間スピン、および5分のスピンドライカラムで2回目を洗う。 10μlのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出する。 6。 cDNA合成単一の読み込みライブラリの最初の鎖の合成： PCRチューブに、以下を追加します。 断片化されたポリ- mRNAの – 10μlのをNotIランダムnonamerのプライマー – 1μL 5サーモサイクラーでの分、そして氷上で迅速な寒さのために70℃でインキュベートする。をNotI Nonamerのプライマー（5' – TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3'）。ランダムな領域がチップのSeqキットからイルミナのアダプタBのシーケンスの逆補数になるまで5'近位のシーケンスは、次のシーケンス間、NotI制限部位です。 <ol="2"を開始> 上記に、（スーパースクリプトIIIキットから）氷の上に以下を追加します。 5Xファーストストランドバッファー-4液 DTT – 2μlの dNTP混合物* – 1.5μL 42℃2分間サーマルサイクラーに入れ° Cは、スーパースクリプトIII逆転写酵素を1μlを追加し、1時間、42℃でインキュベートする。 *代わりにdCTPの、5 – メチルdCTPをdNTP混合物で使用されていました。 ペアエンドライブラリの最初の鎖の合成： PCRチューブに、以下を追加します。 断片化されたポリ- mRNAの – 10μlのランダムヘキサマープライマー – 1μL 5サーモサイクラーでの分、そして氷上で迅速な寒さのために65℃でインキュベートする。 上記に、氷（上付きfirststrand IIIキットから）に以下を追加します。 5Xファーストストランドバッファー – 4μL DTT – 2μlののdNTP（からキット） – 1.5μL 45℃1分間サーマルサイクラーに入れ° Cは、スーパースクリプトIII逆転写酵素を1μlを追加し、1時間45℃でインキュベートする。 第二鎖合成（両方のライブラリ用）： 上記に、（スーパースクリプトIIキットから）氷の上に以下を追加します。 水（RNaseフリー） – 91μL 5Xセカンドストランドバッファー – 30μlののdNTP（キットから） – 3μlの大腸菌DNAリガーゼ – 1μ 大腸菌のDNAポリメラーゼ – 4μL 大腸菌のRNase H – 1μL 反転してミックスチューブは、2時間16での短いスピンとインキュベート° Cを与える。 7。 cDNAの精製 Zymo列、単一の読み取りのための水を40μlで溶出し、ペアエンドライブラリのための水を30μlのcDNAサンプルを精製する。 8。最後の修理シングルリードのライブラリのための： <p c小娘="jove_content">（イルミナチップのSeqサンプルプレップキットを使用してください） cDNAの上記の40μlのために、追加します。 10mMのATPとT4 DNAリガーゼバッファー – 5μlを dNTPミックス – 2μlを T4 DNAポリメラーゼ – 1μL クレノウ酵素（1U /μlに水で1:5に希釈） – 1μlの T4 PNK – 1μL 20℃で30分間サーマルサイクラーでインキュベート℃にペアエンドライブラリのための： （イルミナペアエンドサンプルプレップキットを使用してください） cDNAを上記の30μlのために、追加します。 RNaseをDNaseフリー水 – 45μlの 10mMのATPとT4 DNAリガーゼバッファー – 10μlの 10mMのdNTPミックス – 4μL T4 DNAポリメラーゼ – 5μlを Klenow酵素 – 1μL T4 PNK – 5μlの 20℃で30分間サーマルサイクラーでインキュベート℃に 9。 cDNAのクリーンアップ C cDNAを使用してZymo列を傾く。ペアエンドライブラリの、単一の読み取りとEB 32μlのためのEB 34μlの溶出。 10。 DNA断片の3'末端に'拠点を追加シングルリードのライブラリのための： 以下の反応ミックスを調製する： DNAサンプル – 34μL クレノウバッファ – 5μlの dATPを – 10μlのクレノウエキソ – 1μL 37℃で30分間インキュベート℃、 ペアエンドライブラリのための： 以下の反応ミックスを調製する： DNAサンプル – 32μL クレノウバッファ – 5μlの dATPを – 10μlのクレノウエキソ – 3μlの 37℃で30分間インキュベート℃、 11。 cDNAのクリーンアップ cDNAを使用してzymo列をクリーンアップします。 EB10μlに溶出します。 12。アダプターライゲーションjove_step">単一の読み取りライブラリの場合： （イルミナチップのSeqサンプルプレップキットを使用してください） 以下の反応ミックスを調製する： DNAサンプル – 10μlのアダプターオリゴミックス – 1μL 2X DNAリガーゼ緩衝液- -15μL DNAリガーゼ – 4μL 室温で15分間インキュベートする。アダプタは、氷と希薄化後1時20分に解凍してください。 ペアエンドライブラリのための： （イルミナペアエンドサンプルプレップキットを使用してください） 以下の反応ミックスを調製する： DNAサンプル – 10μlの PEアダプターオリゴミックス – 10μlの 2X DNAリガーゼ緩衝液 – 25μlの DNAリガーゼ – 5μlの 20℃で15分間インキュベート℃、アダプタは、氷と希薄化後1時20分に解凍してください。 13。ライゲーション反応は、クリーンアップ ZYを使用してライゲーション反応をクリーンアップMOの列。ペアエンドライブラリのEBを5μlの別の溶出が続く単一の読み取りライブラリとEBの6μlのための水の44μlの溶出。 NotI消化を行う、唯一の単一の読み取りライブラリ用 cDNAを – 44μL NEBバッファ3から5μlを BSA – 0.5μL をNotI – 1μL 37 ° C、およびzymoカラムを用いた精製反応で一晩に2時間インキュベートする。バッファEB 6μlの溶出は、EBの5μlの2番目の溶出が続きます。 14。サイズの選択/ゲル精製 Invitrogenから2％のSYBR安全なE -ゲルを使用して、次の手順を実行。 プログラム0 -プレラン2分を実行します。 インビトロジェン希釈1:4から1キロバイトプラスはしごをロードし、10μlをロードする。 DNAサンプルのすべてをロードし、そして水10μlで空のレーンを埋める。 プログラムを実行する1 -エーゲル2％は28分を実行します。 サイズは200から300 bpのゲルSLICを選択します。新鮮なカミソリの刃を持つe。 15。ゲルスライスからDNAを溶出ゲルスライスを入れ重量を測定し、（キアゲンからゲル抽出キットを使用）ゲルの1倍量のBuffer QGの3つのボリュームを追加します。 50℃で10分間またはゲルスライスが溶けるまで。 ispropanolの1ボリュームを追加し、反転またはピペッティングにより混和する。 、列に追加し、最高速度で1分間スピン、およびフロースルー捨てます。 、カラムにBuffer QGを500μLを追加し、最大速度で1分間スピン、およびフロースルーを捨てる。 カラムにBuffer PEを750μlのを追加し、最高速度で1分間スピン、およびフロースルーを捨てる。 最高速度で1分間遠心。 ペアエンドライブラリの、単一の読み取りと23μlのEB用EB 36μlの溶出。 16。 PCR シングルリードのライブラリのための： （イルミナチップのSeqサンプルプレップキットを使用してください） followinを準備グラムのPCR反応ミックス： DNA – 36μL 5X Phusionバッファ – 10μlの dNTPミックス – 1.5μL PCRプライマー1.1から1μL PCRプライマー2.1から1μL Phusionポリメラーゼ – 0.5μL 以下のPCRのプロトコルを使用します。 98℃で30秒° C の10サイクル： 98℃で10秒° C 65℃30秒° C 72℃で30秒 72℃5分° C 4℃ホールド° C キットが使用されていること*初めて、EBバッファを使用してPCRプライマー1:2希釈する。 ペアエンドライブラリのための： （イルミナペアエンドサンプルプレップキットを使用してください） 以下のPCR反応を準備します。 DNA – 23μL Phusion DNAポリメラーゼ – 25μlの PCRプライマーPE 1.1から1μL PCRプライマーPE 2.1 -1μL 以下のPCRのプロトコルを使用して増幅する。 98℃で30秒° C の10サイクル： 98℃で10秒° C 65℃30秒° C 72℃で30秒 72℃5分° C 4℃ホールド° C キットが使用されていること*初めて、EBバッファを使用してPCRプライマー1:2希釈する。 17。ライブラリのクリーンアップ zymo列を使用してライブラリをクリーンアップします。 EB 12μlの溶出 18。定量するライブラリ量子ビットを使用してライブラリを定量する。それは、シーケンシングのための準備ができています。単一の読み込みライブラリのV4以上のイルミナ単一の読み取りクラスタ生成キットから配列決定用プライマーとペアエンドライブラリのV4以上のイルミナペアエンドクラスタ生成キットを使用してください。 19。データ分析ボウタイ6 mに使用されたapはRefSeqの遺伝子セット（NCBIのビルド36.1）に読み込みます。シングルエンドの読み取り（30ヌクレオチド）とペアの端には、遺伝子のセットに10試合を許容すること、および読み取り当たり2個のミスマッチを許容するマップされた（42塩基）を読み取ります。百万分の一転写産物（TPM）の値がRSEM 7（期待値最大化によるRNA – Seqを）使用して遺伝子発現を測定するために得られた。 20。代表的な結果：我々は両方のシングルリードとペアエンドのトータルRNAを（図1）から始まる1μgを、100μgの、10μgの、1μgのとは100 pgから実行されるためT7LAライブラリを作った。我々のプロトコルの評価​​については、我々は、10μgの全RNAからこれらのコントロールライブラリを起動するT7 RNA増幅することなく単一の読み取りとペアエンドライブラリを作った"MinAmp"と呼ばれ、最小限の増幅を持っている。彼らが受ける唯一の増幅は、イルミナシーケンシングアダプターを連結するためのプロトコルの終わり近くにすべてのライブラリに共通するステップPCRの10サイクルです。使用されるすべてのRNAは、H14から分離されたヒト胚性幹細胞8。 まず、各種ライブラリ（表1と補足表1）によって同定された遺伝子の数を評価した。両方シングルリードとペアエンドライブラリの場合は、10 ngのT7LAライブラリは10以上のTPMに、10μgのMinAmpライブラリとしての遺伝子のほぼ同じ数を同定した。シングルリードのライブラリの場合には、10 ngのT7LAライブラリには、10μgの未増幅ライブラリによって識別された8500の遺伝子の100％を同定した。ペアエンドライブラリの場合、10 ngのT7LAライブラリには、10μgの未増幅ライブラリ（9267遺伝子の7961）によって同定された遺伝子の86％を同定した。未満は10 ngから作られたライブラリは、多くの遺伝子として同定することができませんでした。例えば、単一の読み取りのプロトコルで、1ngのライブラリにのみ識別さ〜10μgのMinAmpライブラリによって同定された遺伝子の50％を、私達は10 ngまでT7LAプロトコルで使用するためのトータルRNAの最小量を制限するように求める。また、ハウスキーピング遺伝子のマッピング、 GAPDH（図2）出発RNAの少なくとも10ngで行われたすべてのT7LAライブラリが極端な5'エクソンを含む、すべてのエクソンを同定することを示しています。 MinAmpライブラリーとは10 ng T7LAシングルリードとペアエンドライブラリの比較では、類似度の高い（それぞれスピアマン相関、R = 0.90と0.95、図3aとb）を示しています。我々はまた、10 ngのトータルRNAから成る2つの読み取りとペアエンドライブラリを比較し、それらがライブラリの両方のタイプが（非常によく似た遺伝子発現の署名を生成T7LAプロトコルを使用して作られたことを示す、非常に高い相関係数を（R = 0.92）であった図3c）。したがって、T7LAメソッドはMinAmpライブラリなどが、1000倍未満出発原料からのような信頼性の高い包括的なシーケンシングライブラリーを作製することができます。 図1ペアエンドのスキーマと単一の読み取りライブラリ調製プロトコルを。 jove_content"> 図2すべての単一の読み取りとペアエンドライブラリのためのハウスキーピング遺伝子、GAPDH、のゲノムのブラウザの画像。単一の読み込みライブラリの左側のスケールバーは350総読み取りを示しています。ペアエンドライブラリのためのセンターのスケールバーは5000合計が読み取りを示しています。横軸はGAPDHのゲノム配列を表します。 図3各種ライブラリ（スピアマンの）の間で遺伝子発現の相関：ペアエンド間の単一の間A. 10 ngのT7LAを読み、10μgのMinAmpライブラリは両方のこれらのライブラリは非常によく似た遺伝子発現のパターンを（R = 0.90）を持っていることを示しているB. 10 ngのT7LAおよび10μgのMinAmpライブラリは、遺伝子発現プロファイルの類似度（R = 0.95）を示しています。遺伝子の元のCの相関は、10 ngのペアエンド〜10 ngの単一の読み取りライブラリpressionsはT7LA法（R = 0.92）が作成したこれらのライブラリ間の類似度の高い表示。 すべてのシングルリードとペアエンドライブラリーからのヒト胚性幹細胞特異的genes5の図4の同定。 ライブラリ 種類° 生のクラスタ フィルタを通過％クラスタ ゲノムに整列％ ％のエラーレート 同定された遺伝子 MinAmp 10ug シングルリード 225602 + / – 4952 65.48 + / – 2.58 47.61 + / – 0.53 0.62 + / – 0.06 8500 1ug T7LA シングルリード 144818 + / – 6513 82.21 + / – 6.45 48.09 + / – 0.27 0.42 + / – 0.03 8757 100ng T7LA シングルリード 27385 + / – 1818 81.33 + / – 11.75 44.46 + / – 4.53 0.49 + / – 0.10 8709 10ng T7LA シングルリード 11184 + / – 985 60.70 + / – 3.70 14.96 + / – 1.15 0.99 + / – 0.30 8589 1ng T7LA シングルリード 12695 + / – 1365 53.27 + / – 16.76 4.08 + / – 0.79 2.25 + / – 1.56 4720 100pg T7LA シングルリード 10390 + / – 1398 72.99 + / – 2.90 1.48 + / – 0.20 1.51 + / – 0.39 1121 MinAmp 10ug ペアエンドR1 95786 + / – 12937 90.77 + / – 2.79 58.50 + / – 0.95 0.94 + / – 0.38 9267 ペアエンドR2 95786 + / – 12937 90.77 + / – 2.79 58.13 + / – 1.13 0.99 + / – 0.37 1ug T7LA ペアエンドR1 297669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 46.​​89 + / – 0.14 0.47 + / – 0.01 7334 ペアエンドR2 297669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 45.52 + / – 0.12 0.51 + / – 0.01 100ng T7LA ペアエンドR1 205602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 63.44 + / – 1.00 0.48 + / – 0.02 8011 ペアエンドR2 205602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 61.80 + / – 8.09 0.60+ / – 0.36 10ng T7LA ペアエンドR1 214622 + / – 11155 89.98 + / – 1.13 56.32 + / – 1.94 0.80 + / – 0.26 7961 ペアエンドR2 214622 + / – 11155 89.98 + / – 1.13 46.​​41 + / – 18.39 2.48 + / – 2.68 ; 1ng T7LA ペアエンドR1 144951 + / – 19841 90.54 + / – 1.19 3.91 + / – 0.16 8.71 + / – 0.86 8124 ペアエンドR2 144951 + / – 19841 90.54 + / – 1.19 3.27 + / – 1.21 9.11 + / – 3.52 100pg T7LA ペアエンドR1 1876​​00 + / – 11759 89.52 + / – 1.11 1.78 + / – 0.05 13.42 + / – 0.50 6623 </TD> ペアエンドR2 1876​​00 + / – 11759 89.52 + / – 1.11 1.99 + / – 0.23 15.29 + / – 0.96 · R1とR2は前進であり、タグの順序を逆 *≥10 TPM クラスタ番号は上の表1。情報、同定された遺伝子、エラーレート、単一の読み取りおよびペアエンドライブラリのパーセントの位置合わせ。 補足表1。すべてのサンプルのすべての遺伝子とそのTPM値のリスト、単一の読み取りとペア終了。