יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

1. RNA בודד הכולל הוסף 1ml Trizol לתאים / רקמות, homogenize עם מחט 18-22 גזה במידת הצורך. הוסף 200 μl כלורופורם, ואת הספין 14,000 סל"ד במשך 30 דקות 4 ° C. קח את השכבה העליונה מימית, להוסיף 0.5 acrylamide ליניארי μl, ולאחר מכן להוסיף 500 isopropanol μl. בואו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. ספין בסל"ד 14,000 ב 4 ° C, לשטוף גלולה עם 70% אתנול, ו – ואקום יבש. Resuspend במים 1 nuclease μl חופשי להעביר צינור 200 μl PCR. 2. הכן גדילי כפול cDNA כדי RNA 1 לעיל μl להוסיף 1 μl של 100 מיקרומטר אוליגו-DT-T7 פריימר שעתוק לאחור (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 "), חום 70 מעלות צלזיוס (חום לחסום) במשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על הקרח. הוסף 1 FS μl חיץ 5x, DTT μl 0.5, 0.5 ו לערבב dNTP μl 0.5 RnaseOUT μl (מ עילי השנייה ערכה). מחממים עד 42מעלות המכונה PCR דקה 1, ולאחר מכן להוסיף 0.5 transcriptase μl כתב עילי השנייה הפוכה. דגירה עבור שעות 1 ב 42 ° C. מחממים על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, לצנן עד 4 ° C. על קרח, להוסיף את הדברים הבאים התגובה הנ"ל: Nuclease מים חופשי – 22.75 μl חיץ 5X גדיל שני – 7.5 μl dNTP לערבב – 0.75 μl E. coli האנזים דנ"א – 0.25 μl E. coli-DNA פולימראז – μl 1 RnaseH – 0.25 μl דגירה עבור שעה 2 ב 16 ° C ולאחר מכן להוסיף 1 DNA פולימראז μl T4 ו דגירה במשך 10 דקות נוספות ב 16 ° C. העברה צינור 1.5 Eppendorf מ"ל, ולהוסיף 80 μl מים. הוספת 0.5 μl של acrylamide ליניארי. הוסף 72 μl 3 M NH4OAc ו 480 μl של 100% אתנול קר. המשקע עבור שעות 1 ב -20 ° C. ספין בסל"ד 14,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לשטוף עם אתנול מ"ל 1 70%, צנטריפוגה בסל"ד 14,000 עבור 2דקות ויבש למשך כ -10 דקות ואקום. 3. Amplify poly-mRNA על ידי ב שעתוק במבחנה Resuspend מעל cDNA ב 3.5 μl מים חינם nuclease. כדי לעיל, להוסיף 1 μl כל dNTPs (μl הכולל 4), 1 μl של המאגר תגובה 10X ו 1 μl של פולימראז T7, ו 0.5 μl של RnaseOUT מתיק Megascript. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במכונה PCR לילה. מוכן לשלב הבא. ניתן לאחסן ב -80 ° C. 4. פיצול של mRNA מוגבר מרובה הוסף 26 μl מים התגובה מעל 4 הפיצול μl מגיב 10x. מחממים מכונת ה-PCR ב 70 מעלות בדיוק 7 דקות. הוסף 5 μl של חיץ להפסיק את הפיצול, את המדגם על הקרח. 5. RNA לנקות כדי התגובה לעיל, להוסיף 60 μl מים ו 350 μl של RLT חיץ מתיק MinElute Rneasy, ומערבבים על ידי pipetting. הוסף 250 μl אתנול, לערבב ידי pipetting ו פיפטה לתוך עמודה ספין. ספין על RCF 8000 למשך 20 שניות. שטפי פעם עם הרשתית, ספין למשך 20 שניות, לשטוף בפעם השנייה עם EtOH 80%, ספין במשך 2 דקות, ועמודה יבש עם ספין 5 דקות. Elute רנ"א 10 μl מים חינם nuclease. 6. cDNA סינתזה גדיל סינתזה ראשית עבור ספריית לקרוא יחיד: בתוך צינור PCR, להוסיף את הדברים הבאים: קטועה Poly-mRNA – 10 μl NotI פריימר אקראיים nonamer – μl 1 לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות בתוך thermocycler, וצינה מהירה על הקרח. NotI Nonamer פריימר (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT -3 NNNNNNNNN '). רצף הפרוקסימלי '5 הוא האתר מגבלה NotI בעוד הרצף הבא עד לאזור אקראי הוא המשלים להפוך רצף של Illumina מתאם B מ ערכת שבבים Seq. <olלהתחיל = "2"> כדי לעיל, להוסיף את הדברים הבאים על הקרח (מתוך עילי III בערכה): חיץ 5X first גדיל -4 μl DTT – 2 μl dNTP תערובת * – 1.5 μl שימו thermocycler למשך 2 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 μl של transcriptase עילי הפוך III, דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות. * במקום dCTP, 5-methyl dCTP נעשה שימוש בתערובת dNTP. גדיל סינתזה ראשית עבור ספריית סוף לזווג: בתוך צינור PCR, להוסיף את הדברים הבאים: קטועה Poly-mRNA – 10 μl Hexamer פריימר אקראיים – μl 1 לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות thermocycler, וצינה מהירה על הקרח. כדי לעיל, להוסיף את הדברים הבאים על הקרח (מתוך עילי firststrand III בערכה): חיץ 5X גדיל הראשון – 4 μl DTT – 2 μl dNTPs (מ קיט) – 1.5 μl שימו thermocycler דקות 1 ב 45 ° C, להוסיף 1 μl של transcriptase עילי הפוך III, דגירה על 45 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. גדיל סינתזה השני (לספריות שניהם): כדי לעיל, להוסיף את הדברים הבאים על הקרח (מתוך עילי II הערכה): מים (RNase חינם) – 91 μl מאגר 5X סטרנד שני – 30 μl dNTPs (מתיק) – 3 μl E. coli האנזים דנ"א – μl 1 E. coli-DNA פולימראז – 4 μl E. coli RNase H – 1 μl צינור מערבבים ידי היפוך, לתת ספין דגירה קצרה על 16 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. 7. לטהר cDNA לטהר מדגם cDNA עם עמודות Zymo, elute ב 40 μl מים לקרוא יחיד 30 μl מים עבור ספריית סוף לזווג. 8. סיום התיקון עבור ספריית לקרוא יחיד: <p cילדה = "jove_content"> (השתמש Illumina-Chip Seq מדגם ערכת הכנה) כדי μl 40 לעיל של cDNA, להוסיף: האנזים T4 DNA חיץ עם 10mm-ATP – 5 μl dNTP לערבב – 2 μl DNA פולימראז T4 – μl 1 Klenow אנזים (מדוללת 1:05 עם מים 1U / μl) – 1 μl PNK T4 – μl 1 מדגירים את Cycler תרמית במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 ° C. עבור ספריית סוף לזווג: (שימוש במדגם Illumina לזווג סוף ערכת הכנה) כדי μl 30 לעיל cDNA, להוסיף: RNase DNase מים חינם – 45 μl האנזים T4 DNA חיץ עם 10mm-ATP – 10 μl 10mm לערבב dNTP – 4 μl DNA פולימראז T4 – 5 μl Klenow אנזים – 1 μl PNK T4 – 5 μl מדגירים את Cycler תרמית במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 ° C. 9. לנקות cDNA ג רזה עד cDNA עמודות Zymo שימוש. Elute ב 34 μl של EB עבור לקרוא יחיד 32 μl של EB עבור ספריית סוף לזווג. 10. הוסף בסיסים א 'עד הסוף' 3 של קטעי DNA עבור ספריית לקרוא יחיד: מכינים את תערובת התגובה הבאה: דגימת DNA – 34 μl Klenow חיץ – 5 μl dATP – 10 μl Klenow exo – μl 1 דגירה במשך 30 דקות ב 37 ° C. עבור ספריית סוף לזווג: מכינים את תערובת התגובה הבאה: דגימת DNA – 32 μl Klenow חיץ – 5 μl dATP – 10 μl Klenow exo – 3 μl דגירה במשך 30 דקות ב 37 ° C. 11. לנקות cDNA ניקוי cDNA עמודות zymo שימוש. Elute ב 10 μl של EB. 12. מתאם קשירת jove_step "> עבור ספריית לקרוא יחיד: (השתמש Illumina-Chip Seq מדגם ערכת הכנה) מכינים את תערובת התגובה הבאה: דגימת DNA – 10 μl מתאם אוליגו Mix – 1 μl 2X האנזים DNA-Buffer -15 μl האנזים דנ"א – 4 μl דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מתאמי צריך להיות מופשר על קרח 1:20 מדולל. עבור ספריית סוף לזווג: (שימוש במדגם Illumina לזווג סוף ערכת הכנה) מכינים את תערובת התגובה הבאה: דגימת DNA – 10 μl PE מתאם מערבבים אוליגו – 10 μl 2X הצפת האנזים דנ"א – 25 μl האנזים דנ"א – 5 μl דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 20 ° C. מתאמי צריך להיות מופשר על קרח 1:20 מדולל. 13. תגובה קשירת לנקות לנקות את התגובה באמצעות קשירת וףמו עמודות. Elute ב 44 μl מים עבור ספריית לקרוא יחיד 6 μl של EB ואחריו elution אחר μl 5 של EB עבור ספריית סוף לזווג. בצע העיכול NotI, רק לקרוא את ספריה אחת cDNA – 44 μl חוד חיץ 3-5 μl BSA – 0.5 μl NotI – μl 1 דגירה של עד 2 שעות הלילה בשעה 37 ° C, והתגובה לטהר באמצעות טור zymo. Elute עם μl 6 של EB חיץ ואחריו elution שנייה עם 5 μl של EB. 14. מבחר / ג'ל גודל טיהור בצעו את הפעולות הבאות באמצעות 2% בטוח Sybr E-Gel מן Invitrogen. הפעל 0-PreRun תוכנית 2 דקות. טען 1kb פלוס בסולם מ Invitrogen 01:04 בדילול מלא, עומס 10 μl. טעינה של כל דגימת DNA, ולמלא נתיבים ריקים עם 10 μl מים. הפעלת תוכנית 1-EGel 2% הפעלה 28 דקות. בחר גודל 200-300 נ"ב ג'ל slicדואר בסכין גילוח טרי. 15. Elute דנ"א פרוסה ג'ל לשקול פרוסה ג'ל, ולהוסיף 3 כרכים של חיץ QG לנפח של 1 ג'ל (Gel להשתמש הפקת ערכה של Qiagen) לדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד להמסת קריש פרוסה. הוסף 1 נפח ispropanol, ומערבבים על ידי היפוך או pipetting. הוסף ספין טור, למשך 1 דקה במהירות המרבית, וזורקים זרימה דרך. הוסף 500 μl של הצפת QG לעמודה, ספין למשך 1 דקה במהירות המרבית, וזורקים לזרום. הוסף 750 μl של הצפת PE לעמודה, ספין למשך 1 דקה במהירות המרבית, וזורקים לזרום. צנטריפוגה למשך 1 דקה במהירות המרבית. Elute ב 36 μl של EB עבור לקרוא יחיד 23 EB μl עבור ספריית סוף לזווג. 16. PCR עבור ספריית לקרוא יחיד: (השתמש Illumina-Chip Seq מדגם ערכת הכנה) הכן את following-PCR לערבב התגובה: DNA – 36 μl Phusion חיץ 5X – 10 μl dNTP לערבב – 1.5 μl PCR פריימר 1.1-1 μl PCR פריימר 2.1-1 μl פולימראז Phusion – 0.5 μl שימוש בפרוטוקול ה-PCR הבאה: 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס 10 מחזורים של: 10 שניות על 98 מעלות צלזיוס 30 שניות על 65 מעלות צלזיוס 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס 5 דקות 72 ° C תחזיק ב 4 ° C * בפעם הראשונה את הערכה משמש, לדלל PCR עם פריימרים 01:02 חיץ EB. עבור ספריית סוף לזווג: (שימוש במדגם Illumina לזווג סוף ערכת הכנה) הכן את התגובה הבאה PCR: DNA – 23 μl DNA פולימראז Phusion – 25 μl PCR פריימר PE 1.1-1 μl PCR פריימר PE 2.1 -1 μl Amplify באמצעות פרוטוקול ה-PCR הבאה: 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס 10 מחזורים של: 10 שניות על 98 מעלות צלזיוס 30 שניות על 65 מעלות צלזיוס 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס 5 דקות 72 ° C תחזיק ב 4 ° C * בפעם הראשונה את הערכה משמש, לדלל PCR עם פריימרים 01:02 חיץ EB. 17. ספריית לנקות לנקות את הספרייה באמצעות עמודות zymo. Elute ב 12 μl של EB 18. ספריה לכמת ספריה לכמת באמצעות קיוביט. הוא מוכן רצף. השתמש רצף primers מתיק Illumina יחיד לקרוא אשכול דור V4 ומעלה עבור ספריית לקרוא יחיד אשכול Illumina לזווג סוף דור ערכת V4 ומעלה עבור ספריית סוף לזווג. 19. ניתוח נתונים Bowtie 6 שימש מ 'ap קורא להגדיר את הגן RefSeq (צמח השדה בנה 36.1). סוף יחיד קורא (30 נוקליאוטידים), ואת הקצה זוג קורא (42 נוקלאוטידים) מופו המאפשר עד 10 משחקים כדי להגדיר את הגן, ומאפשר עד שני חוסר התאמה לכל לקרוא. תמלילי למיליון (TPM) התקבלו ערכים למדוד ביטוי גנים באמצעות RSEM 7 (RNA-Seq ידי מקסימיזציה-הציפיות). 20. תוצאות נציג: עשינו ספריות T7LA סוף גם לקרוא לזווג אחד פועל מתוך 1 מיקרוגרם, 100 מיקרוגרם, 10 מיקרוגרם, 1 ו – 100 מיקרוגרם pg החל RNA הכולל (איור 1). להערכת פרוטוקול שלנו, עשינו לקרוא יחיד לזווג ספריות סוף בלי הגברה RNA T7-RNA החל מ 10 מיקרוגרם הכולל אלו ספריות שליטה, המכונה "MinAmp", יש הגברה מינימלית. הגברה רק שהם עוברים הם 10 מחזורים של PCR לקראת סוף הפרוטוקול ולקשור מתאמי רצף Illumina, צעד משותף לכל הספריות. בשימוש כל רנ"א היו מבודדים H14אדם בתאי גזע עובריים 8. החוקרים העריכו תחילה את מספר הגנים שזוהו על ידי ספריות שונות (טבלה 1 וטבלה משלים 1). במשך שתי ספריות אחת בסוף לקרוא לזווג, 10 ng ספריות T7LA זיהה כמעט את אותו מספר גנים כמו הספריות MinAmp 10 מיקרוגרם, עם TPM של 10 או יותר. במקרה של הספריות לקרוא יחיד, זיהו את 10 ng T7LA ספריה 100% של 8500 גנים שזוהו על ידי ספריה 10 מיקרוגרם unamplified. עבור ספריות סוף לזווג, זיהו את 10 ng T7LA ספריה 86% מהגנים שזוהו על ידי ספריה 10 מיקרוגרם unamplified (7,961 מתוך 9,267 הגנים). ספריות עשויות ng פחות מ 10 לא הצליחו לזהות כמו גנים רבים. כך, למשל, בפרוטוקול לקרוא יחיד, הספרייה 1 ננוגרם מזוהה רק ~ 50% מהגנים שזוהו על ידי ספריית MinAmp 10 מיקרוגרם, מה שגרם לנו להגביל את הסכום הנמוך ביותר של רנ"א סך לשימוש עם פרוטוקול T7LA כדי ng 10. יתר על כן, מיפוי של גן משק בית, GAPDH (איור 2) מראה כי כל הספריות T7LA עשה עם לפחות 10ng של RNA מתחיל לזהות כל אקסונים, כולל אקסון 5 'קיצוניים. השוואה של 10 ng T7LA ספריות יחיד סוף לקרוא יחד עם הספריות MinAmp מראה רמה גבוהה של דמיון (Spearman המתאם, R = 0.90 ו – 0.95 בהתאמה, איורים 3 א ו – ב). השווינו גם את שתי ספריות אחת בסוף לקרוא לזווג עשוי 10 RNA סך ng והיה להם מקדם מתאם גבוה ביותר (R = 0.92), הוכחת כי שני סוגי ספריות שנעשו באמצעות פרוטוקול T7LA לייצר ביטוי דומה מאוד חתימה גן ( איור 3c).. לפיכך, השיטה T7LA הוא מסוגל לייצר רצף ספריות כי הם אמינים כמו ומקיף כמו הספריות MinAmp, אלא מתוך 1000 פי חומר המוצא פחות. איור 1 סכמה של סוף לזווג והכנת יחיד לקרוא פרוטוקול הספרייה. jove_content "> איור 2 דפדפן הגנום תמונה של גן משק בית, GAPDH, עבור כל ספריות אחד בסוף לקרוא לזווג. סרגל בקנה מידה בצד שמאל של ספריות לקרוא אחד מציין 350 סך קורא. סרגל סולם במרכז עבור הספריות סוף לזווג מציין 5000 סך קורא. הציר האופקי מייצג את רצף הגנום של GAPDH. איור 3 מתאם של ביטויים הגן בין ספריות שונות (של חנית): א. בין יחיד לקרוא 10 ng T7LA ו 10 MinAmp ספריה מיקרוגרם מראה כי הן ספריות אלה יש ביטוי דומה מאוד גן דפוס (R = 0.90) ב לזווג בין סוף 10 ng T7LA ו 10 MinAmp ספריה מיקרוגרם מדגים דמיונם של פרופילי ביטוי גנים (R = 0.95). מתאם ג של גן לשעברpressions לזווג בין סוף 10 ng ו -10 ספריות ng לקרוא יחיד להראות רמה גבוהה של דמיון בין אלה ספריות שהוכן על ידי שיטת T7LA (R = 0.92). איור 4 זיהוי של אדם genes5 תא גזע עובריים ספציפיים את כל הספריות יחיד סוף לקרוא לזווג. ספריה סוג ° Raw אשכולות אשכולות% עובר במסנן יישור% ל הגנום שגיאה% שיעור הגנים שזוהו MinAmp 10ug רווק לקרוא 225,602 + / – 4952 65.48 + / – 2.58 47.61 + / – 0.53 0.62 + / – 0.06 8500 1ug T7LA רווק לקרוא 144,818 + / – 6513 82.21 + / – 6.45 48.09 + / – 0.27 0.42 + / – 0.03 8757 100ng T7LA רווק לקרוא 27,385 + / – 1818 81.33 + / – 11.75 44.46 + / – 4.53 0.49 + / – 0.10 8709 10ng T7LA רווק לקרוא 11,184 + / – 985 60.70 + / – 3.70 14.96 + / – 1.15 0.99 + / – 0.30 8589 1ng T7LA רווק לקרוא 12,695 + / – 1365 53.27 + / – 16.76 4.08 + / – 0.79 2.25 + / – 1.56 4720 100pg T7LA רווק לקרוא 10,390 + / – 1398 72.99 + / – 2.90 1.48 + / – 0.20 1.51 + / – 0.39 1121 MinAmp 10ug סוף מותאמים R1 95,786 + / – 12,937 90.77 + / – 2.79 58.50 + / – 0.95 0.94 + / – 0.38 9267 סוף מותאמים R2 95,786 + / – 12,937 90.77 + / – 2.79 58.13 + / – 1.13 0.99 + / – 0.37 1ug T7LA סוף מותאמים R1 297,669 + / – 10,196 91.35 + / – 0.36 46.89 + / – 0.14 0.47 + / – 0.01 7334 סוף מותאמים R2 297,669 + / – 10,196 91.35 + / – 0.36 45.52 + / – 0.12 0.51 + / – 0.01 100ng T7LA סוף מותאמים R1 205,602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 63.44 + / – 1.00 0.48 + / – 0.02 8011 סוף מותאמים R2 205,602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 61.80 + / – 8.09 0.60+ / – 0.36 10ng T7LA סוף מותאמים R1 214,622 + / – 11,155 89.98 + / – 1.13 56.32 + / – 1.94 0.80 + / – 0.26 7961 סוף מותאמים R2 214,622 + / – 11,155 89.98 + / – 1.13 46.41 + / – 18.39 2.48 + / – 2.68 ; 1ng T7LA סוף מותאמים R1 144,951 + / – 19,841 90.54 + / – 1.19 3.91 + / – 0.16 8.71 + / – 0.86 8124 סוף מותאמים R2 144,951 + / – 19,841 90.54 + / – 1.19 3.27 + / – 1.21 9.11 + / – 3.52 100pg T7LA סוף מותאמים R1 187,600 + / – 11,759 89.52 + / – 1.11 1.78 + / – 0.05 13.42 + / – 0.50 6623 </td> סוף מותאמים R2 187,600 + / – 11,759 89.52 + / – 1.11 1.99 + / – 0.23 15.29 + / – 0.96 ° R1 ו R2 הם קדימה הפוכה רצפים של תג * ≥ 10 TPM טבלה 1. מידע על מספרי מצרר, גנים שזוהו, שיעור שגיאה, יישור אחוז הספריות יחיד סוף לקרוא לזווג. לוח משלים 1. רשימה של כל הגנים ואת הערכים שלהם TPM עבור כל המדגמים, לקרוא יחיד לזווג סוף.