Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d'ARN total
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l'analyse d'expression génique basée sur l'ARN T7 linéaires d'amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d'ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.
Abstract
Séquençage du transcriptome entier par l'ARNm-Seq est maintenant largement utilisée pour effectuer l'expression génique globale, la mutation, l'allèle spécifique d'expression et d'autres analyses du génome entier. ARNm-Seq ouvre même la porte pour l'analyse de l'expression du gène de la non-séquencé les génomes. ARNm-Seq offre une sensibilité élevée, une large gamme dynamique et permet de mesurer le nombre de copies transcription dans un échantillon. Analyseur d'Illumina génome effectue le séquençage d'un grand nombre (> 10 7) de la séquence relativement courte lit (<150 pb). La «fin jumelé" approche, dans laquelle une seule lecture longue est séquencé à ses deux extrémités, permet de suivre les jonctions d'épissage alternatif , insertions et suppressions, et est utile pour l'assemblage de novo du transcriptome.
L'un des défis majeurs auxquels sont confrontés les chercheurs est une quantité limitée de matériau de départ. Par exemple, dans des expériences où les cellules sont récoltées par laser de micro-dissection, disponible à partir d'ARN totaux may mesure en nanogrammes. Préparation de l'ARNm-Seq bibliothèques à partir de ces échantillons ont été décrites 1, 2, mais implique une quantité importante d'amplification PCR qui peuvent introduire des biais. Autres ARN-Seq procédures de construction de bibliothèque avec un minimum d'amplification PCR ont été publiés 3, 4, mais exigent des quantités microgramme de l'ARN total de départ.
Nous décrivons ici un protocole pour la plateforme Illumina Genome Analyzer II pour l'ARNm-Seq séquençage pour la préparation de la bibliothèque qui évite significative l'amplification par PCR et ne requiert que 10 nanogrammes d'ARN total. Bien que ce protocole a été décrit précédemment et validés pour une seule fin de séquençage 5, où il a été montré pour produire des bibliothèques sans introduire de biais directionnel amplification significative, il est ici de valider encore pour être utilisé comme un protocole de fin appariées. Nous amplifier sélectivement les ARN messagers polyadénylé de commencer ARN total en utilisant la T7 basée Eberwine méthode d'amplification linéaire, inventé "T7LA "(T7 linéaires d'amplification). Le amplifié ARNm poly-A sont fragmentés, une transcription inverse et l'adaptateur ligaturés pour produire la bibliothèque séquençage final. Pour les deux courses seule fin de lecture et appariés, les séquences sont mappés à l'homme du transcriptome 6 et normalisée de sorte que les données de plusieurs exécutions peuvent être comparés. Nous rapportons la mesure d'expression génique dans des unités de transcriptions par million (TPM), qui est une mesure supérieure à RPKM lorsque l'on compare les échantillons 7.
Protocol
1. Isoler l'ARN total Ajouter 1ml Trizol aux cellules / tissus, et homogénéiser à l'aiguille de 18 à 22 de gaze, si nécessaire. Ajouter 200 ul de chloroforme, et tournent à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C. Sortez dessus couche aqueuse, on ajoute 0,5 ul acrylamide linéaire, puis ajouter 500 ul d'isopropanol. Laissez reposer à température ambiante pendant 20 minutes. Centrifuger à 14000 rpm à 4 ° C à granulés, laver avec de l'éthanol à 70%, et le vide sec. Remettre en suspension dans l'eau une nucléase ul libre et transfert à 200 tubes PCR ul. 2. Préparer ADNc double brin Pour l'ARN 1 ci-dessus ul ajouter 1 l de 100 M d'oligo-dT-T7 apprêt transcription inverse (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), de la chaleur à 70 ° C (bloc chauffant) pendant 5 min, et enclenchez refroidir sur glace. Ajouter 1 pl de tampon FS 5x, DTT 0,5 ul, 0,5 ul mélange de dNTP et 0,5 RnaseOUT ul (de SuperScript II kit). Chauffer à 42° C en machine à PCR pour 1 minute, puis ajouter 0,5 transcriptase inverse Superscript II ul. Incuber pendant 1 heure à 42 ° C. Chauffer à 70 ° C pendant 10 minutes, refroidir à 4 ° C. Sur la glace, ajoutez la ligne suivante à la réaction ci-dessus: Nucléase sans eau – 22,75 ul 5X tampon second brin – 7,5 ul dNTP mix – 0,75 ul E. coli ADN ligase – 0,25 ul Polymérase ADN de E. coli – 1 pl RNaseH – 0,25 ul Incuber pendant 2 heures à 16 ° C, puis ajouter une polymérase ul d'ADN de T4, et incuber pendant 10 minutes à 16 ° C. Transfert à l'eppendorf de 1,5 ml du tube, l'eau et ajouter 80 ul. Ajouter 0,5 ul d'acrylamide linéaire. Ajouter 72 ul 3 M et 480 ul NH4OAC d'éthanol 100% froid. Précipiter pendant 1 heure à -20 ° C. Centrifuger à 14000 rpm à 4 ° C pendant 30 minutes, laver avec 1 ml d'éthanol à 70%, centrifuger à 14000 rpm pendant 2minutes, et le vide sec pendant environ 10 minutes. 3. Amplifier l'ARNm poly-A par transcription in vitro Resuspendre-dessus d'ADNc dans l'eau 3,5 ul nucléase libre. Pour ce qui précède, ajouter 1 ul chacun des dNTP (total 4 pl), 1 pl de tampon de réaction 10X et 1 pl de la polymérase T7, et 0,5 l de RnaseOUT du kit Megascript. Incuber à 37 ° C en machine à PCR durant la nuit. Prêt pour la prochaine étape. Peut être stockés à -80 ° C. 4. La fragmentation des amplifié l'ARNm poly-A Ajouter 26 ul d'eau à la réaction ci-dessus et réactif 4 ul de fragmentation 10x. Chauffer dans la machine à PCR à 70 ° C pendant exactement 7 minutes. Ajouter 5 ul de tampon d'arrêt de fragmentation, l'échantillon mis sur la glace. 5. ARN nettoyer Pour la réaction ci-dessus, ajouter 60 ul d'eau et 350 l de tampon RLT à partir MinElute kit RNeasy, et mélanger par pipetage. Ajouter 250 ul d'éthanol, mélanger par pipetage et pipette dans la colonne. Spin à 8000 rcf pendant 20 secondes. Laver une fois avec l'EPR, le spin pendant 20 secondes, laver deuxième fois avec EtOH 80%, le spin pendant 2 minutes, et la colonne sèche avec 5 tour minute. Eluer ARN dans 10 ul d'eau nucléase libre. 6. synthèse de l'ADNc Synthèse du premier brin pour la bibliothèque de lecture seule: Dans un tube de PCR, ajouter ce qui suit: Fragmenté Poly-A ARNm – 10 ul Notl amorce aléatoire nonamère – 1 pl Incuber à 70 ° C pendant 5 minutes dans un thermocycleur, et refroidissement rapide sur la glace. Notl nonamère Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT -3 NNNNNNNNN '). La séquence 5 'proximal est le site de restriction Notl alors que la séquence suivante jusqu'à ce que la région aléatoire est le complément inverse de la séquence d'Illumina adaptateur B du Chip-Seq kit. <olstart = "2"> Pour ce qui précède, ajoutez la ligne suivante sur la glace (à partir SuperScript III kit): 5X ul de tampon premier brin -4 TNT – 2 pl mélange de dNTP * – 1,5 pl Mettez thermocycleur pendant 2 minutes à 42 ° C, ajouter 1 l de SuperScript III de la transcriptase inverse, et incuber à 42 ° C pendant 1h. * Au lieu de dCTP, 5-méthyl dCTP a été utilisé dans le mélange de dNTP. Synthèse du premier brin pour la bibliothèque de la fin appariés: Dans un tube de PCR, ajouter ce qui suit: Fragmenté Poly-A ARNm – 10 ul Primer hexamère aléatoire – 1 pl Incuber à 65 ° C pendant 5 minutes dans un thermocycleur, et refroidissement rapide sur la glace. Pour ce qui précède, ajoutez la ligne suivante sur la glace (à partir SuperScript firststrand kit III): 5X tampon de premier brin – 4 pl TNT – 2 pl dNTP (à partirkit) – 1,5 pl Mettez thermocycleur pendant 1 min à 45 ° C, ajouter 1 l de SuperScript III de la transcriptase inverse, et incuber à 45 ° C pendant 1 heure. Synthèse du second brin (pour les deux bibliothèques): Pour ce qui précède, ajoutez la ligne suivante sur la glace (à partir SuperScript II kit): Eau (RNase) – 91 ul 5X Buffer deuxième brin – 30 pl dNTP (du kit) – 3 pl E. coli ADN ligase – 1 pl Polymérase ADN de E. coli – 4 pl E. coli RNase H – 1 pl Mélanger par inversion du tube, donnent un bref essorage et incuber à 16 ° C pendant 2 heures. 7. Purifier l'ADNc Purifier l'échantillon d'ADNc avec des colonnes Zymo, éluer dans 40 l d'eau pour la lecture seule et 30 pl d'eau pour la bibliothèque de la fin appariées. 8. Fin de réparation Pour la bibliothèque de lecture seule: <p class = "jove_content"> (Utilisation d'Illumina Chip-Seq échantillon de préparation kit) Pour l'supérieures à 40 ul d'ADNc, ajouter: T4 de tampon ligase d'ADN de 10mm ATP – 5 pl dNTP mix – 2 pl ADN polymérase T4 – 1 pl L'enzyme de Klenow (dilué 1:5 avec de l'eau à 1U / ul) – 1 pl PNK T4 – 1 pl Incuber dans le thermocycleur pendant 30 minutes à 20 ° C. Pour la bibliothèque de la fin appariés: (Utilisez Illumina échantillon apparié fin de préparation le kit) Pour l'ADNc-dessus de 30 ul, ajouter: RNase DNase eau libre – 45 ul T4 de tampon ligase d'ADN de 10mm ATP – 10 ul 10 mM de dNTP mix – 4 pl ADN polymérase T4 – 5 pl L'enzyme de Klenow – 1 pl PNK T4 – 5 pl Incuber dans le thermocycleur pendant 30 minutes à 20 ° C. 9. ADNc de nettoyage C adossez ADNc colonnes Zymo aide. Eluer dans 34 ul d'EB pour seule lecture et 32 ul d'EB pour la bibliothèque de la fin appariées. 10. Ajouter 'A' des bases à l'extrémité 3 'des fragments d'ADN Pour la bibliothèque de lecture seule: Préparer le mélange de réaction suivant: Échantillon d'ADN – 34 ul Klenow tampon – 5 pl dATP – 10 ul Klenow exo – 1 pl Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. Pour la bibliothèque de la fin appariés: Préparer le mélange de réaction suivant: Échantillon d'ADN – 32 ul Klenow tampon – 5 pl dATP – 10 ul Klenow exo – 3 pl Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. 11. ADNc de nettoyage Nettoyer ADNc colonnes Zymo aide. Eluer dans 10 ul d'EB. 12. Ligature adaptateur jove_step "> Pour lire la bibliothèque unique: (Utilisez Illumina Chip-Seq échantillon de préparation kit) Préparer le mélange de réaction suivant: Échantillon d'ADN – 10 ul Adaptateur Oligo Mix – 1 pl 2X ADN ligase Tampon-ul -15 ADN ligase – 4 pl Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Adaptateurs doivent être décongelés sur la glace et 01h20 diluée. Pour la bibliothèque de la fin appariés: (Utilisez Illumina échantillon apparié fin de préparation le kit) Préparer le mélange de réaction suivant: Échantillon d'ADN – 10 ul PE adaptateur Oligo Mix – 10 ul 2X ADN ligase Tampon – 25 ul ADN ligase – 5 pl Incuber pendant 15 minutes à 20 ° C. Adaptateurs doivent être décongelés sur la glace et 01h20 diluée. 13. Réaction de ligature nettoyer Nettoyer la réaction de ligature en utilisant zycolonnes mo. Eluer dans 44 l d'eau pour la bibliothèque de lecture simples et 6 ul d'EB suivie par une autre élution de 5 pi d'EB pour la bibliothèque de la fin appariées. Effectuer une digestion Notl, UNIQUEMENT pour lire seule bibliothèque ADNc – 44 ul ONE tampon de 3 à 5 ul BSA – 0,5 ul Notl – 1 pl Incuber pendant 2 heures à une nuit à 37 ° C, et la réaction de purifier en utilisant la colonne Zymo. Eluer avec 6 l de tampon EB suivie par une seconde élution avec 5 pi de EB. 14. Taille de sélection / Gel de purification Effectuez les opérations suivantes en utilisant un Sybr 2% Safe E-Gel chez Invitrogen. Exécuter le programme 0-PreRun 2 minutes. Charge 1kb en plus l'échelle d'Invitrogen dilué 1:4, et une charge de 10 pi. Chargez tous d'échantillon d'ADN, et de remplir ruelles vides avec 10 pl d'eau. Exécuter le programme 1-Egel 2% Run 28 minutes. Choisir la taille de 200 à 300 pb sur gel slice avec une lame de rasoir propre. 15. L'ADN à partir Eluer tranche de gel Peser tranche de gel, et ajoutez 3 volumes de tampon QG pour 1 volume de gel (kit d'extraction utiliser du gel de Qiagen) Incuber à 50 ° C pendant 10 minutes ou jusqu'à ce que tranche de gel se dissout. Ajouter 1 volume de isopropanol et mélanger par inversion ou de pipetage. Ajouter à colonne, tour pendant 1 minute à vitesse maximale, et jetez accréditives. Ajouter 500 pi de tampon QG de la colonne, le spin pendant 1 minute à vitesse maximale, et jetez-les traverser. Ajouter 750 pi de tampon PE à la colonne, le spin pendant 1 minute à vitesse maximale, et jetez-les traverser. Centrifuger 1 minute à vitesse maximale. Eluer dans 36 ul d'EB pour seule lecture et 23 EB ul pour la bibliothèque de la fin appariées. 16. PCR Pour la bibliothèque de lecture seule: (Utilisez Illumina Chip-Seq échantillon de préparation kit) Préparer le following de mélange réactionnel de PCR: DNA – 36 ul Buffer Phusion 5X – 10 ul dNTP mix – 1,5 pl Amorces PCR de 1,1 à 1 ul Amorces PCR de 2,1 à 1 ul Polymérase Phusion – 0,5 ul Utilisez le protocole de PCR suivantes: 30 secondes à 98 ° C 10 cycles de: 10 secondes à 98 ° C 30 secondes à 65 ° C 30 secondes à 72 ° C 5 minutes à 72 ° C Tenir à 4 ° C * La première fois que le kit est utilisé, diluer amorces PCR 01h02 avec le tampon EB. Pour la bibliothèque de la fin appariés: (Utilisez Illumina échantillon apparié fin de préparation le kit) Préparer la réaction de PCR suivantes: DNA – 23 ul ADN polymérase Phusion – 25 ul Amorce de PCR PE de 1,1 à 1 ul Amorce de PCR PE 2.1 -1 pl Amplifier l'aide de la PCR suivant le protocole: 30 secondes à 98 ° C 10 cycles de: 10 secondes à 98 ° C 30 secondes à 65 ° C 30 secondes à 72 ° C 5 minutes à 72 ° C Tenir à 4 ° C * La première fois que le kit est utilisé, diluer amorces PCR 01h02 avec le tampon EB. 17. Bibliothèque nettoyer Nettoyer la bibliothèque de l'aide de colonnes Zymo. Eluer dans 12 ul d'EB 18. Quantifier la bibliothèque Bibliothèque de quantifier à l'aide qubit. Il est prêt pour le séquençage. Utilisez amorces de séquençage d'Illumina seul kit pôle lire génération V4 ou plus pour la bibliothèque de lecture unique et Illumina kit jumelé génération de la fin du cluster V4 ou plus pour la bibliothèque de la fin appariées. 19. L'analyse des données Bowtie 6 a été utilisé pour mAP lit à l'ensemble des gènes RefSeq (NCBI Construire 36,1). La fin seule lit (30 nucléotides) et la fin paire lit (42 nucléotides) ont été cartographiés permettant jusqu'à 10 matches pour l'ensemble des gènes, et en permettant jusqu'à deux décalages par lecture. Transcriptions par million (TPM) les valeurs ont été obtenues pour mesurer l'expression génique utilisant RSEM 7 (ARN-Seq par Expectation-Maximisation). 20. Les résultats représentatifs: Nous avons fait pour les deux bibliothèques T7LA extrémité simple lecture et va de paire 1 ug, 100 ug, 10 ug, 1 ug et 100 pg de départ ARN total (figure 1). Pour l'évaluation de notre protocole, nous avons fait simple lecture et les bibliothèques jumelé fin sans T7 RNA amplification à partir de 10 ug d'ARN total, ces bibliothèques de contrôle, appelée "MinAmp", avoir une amplification minimale. L'amplification seulement ils subissent les 10 cycles de PCR à proximité de la fin du protocole de ligaturer les adaptateurs Illumina séquençage, une étape commune à toutes les bibliothèques. Tous les ARN utilisés ont été isolés à partir H14cellules souches embryonnaires humaines 8. Nous avons d'abord évalué le nombre de gènes identifiés par les diverses bibliothèques (tableau 1 et tableau 1 supplémentaire). Pour les deux bibliothèques seule fin de lecture et appairé, le 10 ng bibliothèques T7LA identifié près le même nombre de gènes que les bibliothèques 10 MinAmp mg, avec un TPM de 10 ou plus. Dans le cas des bibliothèques seule lecture, la bibliothèque de 10 ng T7LA identifié 100% des 8500 gènes identifiés par la bibliothèque 10 ug non amplifiée. Pour les bibliothèques fin jumelé, le 10 ng T7LA bibliothèque identifié 86% des gènes identifiés par la bibliothèque 10 ug non amplifié (7961 du 9267 gènes). Les bibliothèques fabriqués à partir de moins de 10 ng n'ont pas été en mesure d'identifier que beaucoup de gènes. Par exemple, dans le protocole de lecture unique, la bibliothèque de 1 ng identifié seulement ~ 50% des gènes identifiés par la bibliothèque 10 ug MinAmp, nous incitant à limiter le plus faible quantité d'ARN total pour une utilisation avec le protocole T7LA à 10 ng. Par ailleurs, la cartographie d'un gène de ménage, GAPDH (Figure 2) montre que toutes les bibliothèques T7LA faite avec au moins 10 ng d'ARN de départ identifié tous les exons, y compris les 5 extrêmes 'exon. Comparaison de la 10 ng T7LA seule fin de lecture et des bibliothèques jumelé avec les bibliothèques MinAmp montre un degré élevé de similitude (corrélation de Spearman, R = 0,90 et 0,95 respectivement, les figures 3a et b). Nous avons également comparé les deux bibliothèques seule fin de lecture et jumelés fabriqués à partir de 10 ng d'ARN total et ils avaient un coefficient de corrélation très élevé (r = 0,92), démontrant que les deux types de bibliothèques en utilisant le protocole T7LA produire une signature génétique très semblable expression ( Figure 3c).. Ainsi, la méthode T7LA est capable de produire des bibliothèques de séquençage qui sont aussi fiables et complètes que les bibliothèques MinAmp, mais à partir de 1000 fois moins de matières de départ. Figure 1 Schéma de fin appariées et simple du protocole lisez la préparation de la bibliothèque. jove_content "> Figure 2 Une image navigateur génome d'un gène de ménage, GAPDH, pour toutes les bibliothèques seule fin de lecture et appariés. La barre d'échelle sur la gauche pour les bibliothèques seule lecture indique 350 Nombre de lectures. La barre d'échelle dans le centre pour les bibliothèques jumelé fin 5000 indique Nombre de lectures. L'axe horizontal représente la séquence du génome de la GAPDH. Figure 3 Corrélation des expressions de gènes entre les différentes bibliothèques (Spearman):. A. Entre lecture unique de 10 ng T7LA et 10 bibliothèques MinAmp mg montre que ces deux bibliothèques ont un modèle de gènes très similaires d'expression (R = 0,90) B. Entre fin jumelé 10 ng T7LA et 10 bibliothèques MinAmp mg démontre leur similitude des profils d'expression génique (R = 0,95). C. Corrélation de gène expressions comprises entre 10 ng fin jumelés et 10 ng seule bibliothèques lus montrent un degré élevé de similitude entre ces bibliothèques préparé par la méthode T7LA (R = 0,92). Figure 4: Identification des ressources humaines genes5 les cellules souches embryonnaires spécifiques de toutes les bibliothèques seule fin de lecture et appariés. Bibliothèque ° Type Clusters Raw Clusters% passant de filtre Alignement% au génome Taux d'erreur% Les gènes identifiés MinAmp 10ug Seule lecture 225 602 + / – 4952 65,48 + / – 2,58 47,61 + / – 0,53 0,62 + / – 0,06 8500 1UG T7LA Seule lecture 144 818 + / – 6513 82,21 + / – 6,45 48,09 + / – 0,27 0,42 + / – 0,03 8757 100 ng T7LA Seule lecture 27 385 + / – 1818 81,33 + / – 11.75 44,46 + / – 4,53 0,49 + / – 0,10 8709 10ng T7LA Seule lecture 11 184 + / – 985 60,70 + / – 3,70 14,96 + / – 1,15 0,99 + / – 0,30 8589 1ng T7LA Seule lecture 12 695 + / – 1365 53,27 + / – 16.76 4,08 + / – 0,79 2,25 + / – 1,56 4720 100 pg T7LA Seule lecture 10 390 + / – 1398 72,99 + / – 2,90 1,48 + / – 0,20 1,51 + / – 0,39 1121 MinAmp 10ug R1 Fin jumelés 95 786 + / – 12937 90,77 + / – 2,79 58,50 + / – 0,95 0,94 + / – 0,38 9267 R2 Fin jumelés 95 786 + / – 12937 90,77 + / – 2,79 58,13 + / – 1,13 0,99 + / – 0,37 1UG T7LA R1 Fin jumelés 297 669 + / – 10196 91,35 + / – 0,36 46,89 + / – 0,14 0,47 + / – 0,01 7334 R2 Fin jumelés 297 669 + / – 10196 91,35 + / – 0,36 45,52 + / – 0,12 0,51 + / – 0,01 100 ng T7LA R1 Fin jumelés 205 602 + / – 9932 90,53 + / – 0,76 63,44 + / – 1,00 0,48 + / – 0,02 8011 R2 Fin jumelés 205 602 + / – 9932 90,53 + / – 0,76 61,80 + / – 8,09 0,60+ / – 0,36 10ng T7LA R1 Fin jumelés 214 622 + / – 11155 89,98 + / – 1,13 56,32 + / – 1,94 0,80 + / – 0,26 7961 R2 Fin jumelés 214 622 + / – 11155 89,98 + / – 1,13 46,41 + / – 18.39 2,48 + / – 2,68 ; 1ng T7LA R1 Fin jumelés 144 951 + / – 19841 90,54 + / – 1,19 3,91 + / – 0,16 8,71 + / – 0,86 8124 R2 Fin jumelés 144 951 + / – 19841 90,54 + / – 1,19 3,27 + / – 1,21 9,11 + / – 3,52 100 pg T7LA R1 Fin jumelés 187 600 + / – 11759 89,52 + / – 1,11 1,78 + / – 0,05 13,42 + / – 0,50 6623 </td> R2 Fin jumelés 187 600 + / – 11759 89,52 + / – 1,11 1,99 + / – 0,23 15,29 + / – 0,96 ° R1 et R2 sont des séquences de marche avant et arrière d'une balise * ≥ 10 TPM Tableau 1. Informations sur les numéros cluster, les gènes identifiés, le taux d'erreur, l'alignement pour cent des bibliothèques seule fin de lecture et appariés. Tableau complémentaire 1. Liste de tous les gènes et leurs valeurs TPM pour tous les échantillons, de lire seul et couplé fin.
Discussion
Les protocoles actuels pour rendre les bibliothèques fin jumelé nécessitent entre 1 ug de 9 à 2,5 mg 10 montant de départ de l'ARN total. Ici, nous présentons nos amplification linéaire basée T7 (T7LA) méthode pour préparer à la fois simple lecture et les bibliothèques jumelé Illumina fin de séquençage et montrent que cette méthode permet la génération de bibliothèques d'aussi peu que 10 ng d'ARN total, la production de données qui est comparable à celle de minimalement amplifiées (MinAmp) fabriqués à partir de 1000 bibliothèques du matériel fois plus de départ (10 ug d'ARN totaux). Les 10 bibliothèques ng non seulement identifier similaires du nombre total de gènes, mais aussi de produire des signatures d'expression génique qui sont similaires (figures 3a et b). Par ailleurs, à la fois la seule fin de lecture et des bibliothèques jumelé produites par la méthode T7LA sont très semblables les uns aux autres (figure 3C), qui permet aux chercheurs de comparer les données générées par les bibliothèques à partir de deux protocoles. Depuis ces bibliothèques ont été préparés à partir d'embryons humains ARN des cellules souches, nous avons cherchépour les 30 gènes de cellules souches spécifiques entre les bibliothèques et constatent que la quasi-totalité de ces gènes (93-100%) sont identifiés par les bibliothèques fabriqués à partir d'au moins 10 ng d'ARN total de départ (figure 4), validant ainsi notre protocole. Nous croyons que notre protocole serait très utile pour les chercheurs, en particulier dans des circonstances telles que des cellules d'écoulement triés ou laser micro-disséqués tissus où le matériel de départ est limitant. Dans de telles circonstances, notre protocole permettrait la génération de données d'expression génique comparables aux bibliothèques fabriqués à partir de beaucoup plus grande quantité de départ, car notre protocole produit des profils d'expression comparables à travers au moins 3 ordres de grandeur de l'ARN de départ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement de l'Institut de recherche et d'Morgridge l'Université du Wisconsin Foundation. Nous tenons à remercier Krista Eastman pour son assistance éditoriale.
Materials
| Company | Kit/Reagent | Catalog # | Special Comments |
| Ambion | Fragmentation reagent | AM8740 | |
| Ambion | Liner Acrylamide | AM9520 | |
| Ambion | MEGAscript T7 Kit | AM1334 | |
| Ambion | Non DEPC treated nuclease free water | AM9932 | |
| Fermentas | dNTP set | R0181 | |
| Fermentas | methylated dNTPs | R0431 | For Single Read sample prep only |
| Illumina | TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
| Illumina | TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | FC-104-5001 | |
| Illumina | Chip Seq Sample Prep Kit | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
| Illumina | TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
| Illumina | Paired End Sample Prep Kit | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
| Invitrogen | 1kb plus ladder | 10787-018 | |
| Invitrogen | E. coli Rnase H | 18021-014 | |
| Invitrogen | Rnase Out | 10777-019 | |
| Invitrogen | 2nd strand buffer 5x | 10812-014 | |
| Invitrogen | E. coli DNA polymerase | 18010-017 | |
| Invitrogen | E-gel SYBR safe 2% | G521802 | |
| Invitrogen | Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | 18080-085 | |
| Invitrogen | Trizol | 12183555 | |
| Invitrogen | RNA quibit assay kit | Q32852 | |
| Invitrogen | dsDNA HS qubit assay kit | Q32851 | |
| Invitrogen | E. coli DNA ligase | 18052-019 | |
| Invitrogen | T4 DNA Polymerase | 18005-025 | |
| Invitrogen | Ultra Pure Dnase Rnase water | 10977-015 | |
| Invitrogen | Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | 11917-020 | |
| Invitrogen | Random Primer (invitrogen) | 48190-011 | For paired end sample prep only |
| IDT | Not1Nonamer B primer | N/A | For Single Read sample prep only |
| IDT | Oligo dT T7 | N/A | |
| NEB | Not1 digestion kit | R0189S | For Single Read sample prep only |
| Qiagen | Rneasy Minelute kit | 74204 | |
| Qiagen | RNEasy Mini Kit (50) | 74104 | |
| Qiagen | Gel purification kit | 28604 | |
| Qiagen | Dnase set | 79254 | |
| Qiagen | Rneasy MinElute kit | 74204 | |
| Zymo Research | DNA clean and concentrator (250X) | D4014 |
References
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MRNA-SeqIllumina LibrariesGlobal Gene ExpressionMutation AnalysisAllele-specific ExpressionGenome-wide AnalysesNon-sequenced GenomesTranscript Copy NumbersIllumina’s Genome AnalyzerPaired End SequencingAlternate Splice JunctionsInsertions And DeletionsDe Novo Transcriptome AssemblyLimited Starting MaterialNanograms Of Total RNAPCR AmplificationMinimal PCR Amplification
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Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti, V., Nguyen, B. K., Thomson, J. A., Elwell, A. L., Stewart, R. Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA. J. Vis. Exp. (56), e3340, doi:10.3791/3340 (2011).